[发明专利]IiPLR1氨基酸定点突变蛋白及其编码的基因和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体为IiPLR1定点突变蛋白、编码的基因及其在调控木脂素生物合成中的应用。松脂醇还原酶IiPLR1在S98N、V46L、I181F、S98H、V46A、S98A、I181A上定点突变均能有效提高酶蛋白催化合成落叶松脂素的效率，促进落叶松脂素的有效积累，提高活性木脂素落叶松脂素的合成效率，并且不会生成非活性成分木脂素开环异落叶松脂素。本发明通过氨基酸定点突变首次实现了IiPLR1对板蓝根抗病毒活性成分落叶松脂素的精准调控，为菘蓝(板蓝根)的品质提升和可持续利用提供了全新策略。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为IiPLR1定点突变蛋白、编码的基因及其 在调控木脂素生物合成中的应用。

背景技术

菘蓝（Isatis indigotica Fort.），十字花科（Cruciferae）菘蓝属（Isatis）植物，又名大靛，其根入药，即为常用中药板蓝根（Isatidis Radix），根据中华人民共和国药典记载，具有清热解毒，凉血利咽等功效，临床用于流行性感冒、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎、带状疱疹等疾病治疗。

板蓝根化学成分研究发现木脂素类化合物，如落叶松脂素（Lariciresinol, Lar）和落叶松脂素苷（Lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside）具有显著的抗病毒活性。研究发现落叶松脂素苷可以抑制流感病毒诱导的炎症反应，其衍生物Clemastanin B [7S,8R,8'R-(-)-lariciresinol-4,4'-bis-O-β-D-glucopyranoside]具有抗甲型和乙型流感病毒的活性。以上研究表明以落叶松脂素为代表的木脂素类成分是板蓝根发挥抗病毒活性的重要物质基础。

然而，板蓝根中落叶松脂素的含量极低，平均仅为68μg/g。本实验室前期研 究发现IiPLR1(松脂醇还原酶)是菘蓝落叶松脂素生物合成的关键酶，过量表 达IiPLR1将菘蓝毛状根中落叶松脂素的含量提高了6.3倍。

尽管如此，IiPLR1对落叶松脂素的调控效果仍有待优化。体外催化功能研 究表明，IiPLR1不仅能催化松脂醇生成落叶松脂素，还能进一步催化落叶松脂 素生成开环落叶松脂素(Sec)，且具有相当的催化效率(kcat/Km≈1μM–1min–1)。 为了更好实现IiPLR1对落叶松脂素的精准调控，需要对IiPLR1进行结构生物学 研究，通过目标定点突变获得了一系列IiPLR1氨基酸定点突变蛋白，从而找到 有效提高酶蛋白催化合成落叶松脂素效率的定点突变蛋白，以实现IiPLR1对板 蓝根抗病毒活性成分落叶松脂素的精准调控，为菘蓝(板蓝根)的品质提升和可 持续利用提供全新策略。

发明内容

本发明旨在提供IiPLR1氨基酸定点突变蛋白及应用。

本发明的另一个目的是提供一种合成落叶松脂素的方法。

本发明的技术方案如下：一种IiPLR1氨基酸定点突变蛋白，其氨基酸序列 是SEQID No.1～7所示的任一种。

即，所述IiPLR1氨基酸定点突变蛋白，是SEQ ID No.8所示的IiPLR1蛋白 氨基酸序列(GenBank No.AEA42007.1)发生以下定点突变：

(1)SEQ ID No.1：第98位的S变为A(S98A)；或者，

(2)SEQ ID No.2：第98位的S变为N(S98N)；或者，

(3)SEQ ID No.3：第98位的S变为H(S98H)；或者，

(4)SEQ ID No.4：第46位的V变为A(V46A)；或者，

(5)SEQ ID No.5：第46位的V变为L(V46L)；或者，

(6)SEQ ID No.6：第181位的I变为F(I181F)；或者，