[发明专利]一种鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组及其试剂盒和应用

权利要求书

1.一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物探针组，其特征在于，包含检测PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性正向引物、反向引物、特异性荧光探针及竞争性引物；其中，

PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

PML-RARα融合基因bcr2和bcr3剪切体特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

竞争性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

所述PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性荧光探针5’端分别标记有不同的荧光基团。

2.权利要求1所述的引物探针组在鉴定PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体或在制备鉴别PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的检测试剂盒中的应用；所述鉴定为非疾病诊断目的。

3.一种非疾病诊断目的鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的多重荧光PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取样品RNA；

S2.利用权利要求1所述的引物探针组对步骤S1所述样品RNA进行一步法多重荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判定：通过扩增曲线进行判定，若扩增曲线呈明显单一S型曲线，则判定样品中有PML-RARα融合基因；再根据S型曲线对应的荧光通道，判定PML-RARα融合基因的型别。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2为一步法real-time RT-PCR反应，每人份PCR扩增反应体系包括逆转录酶1～3U、热启动Taq酶2～5U、dNTPs为6～12mmol、PCR缓冲液、PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性的正向引物、反向引物、竞争性引物、PML-RARα融合基因特异性荧光探针。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性正向引物正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L，所述竞争性引物的扩增体系终浓度均为0.9μmol/L，所述bcr1和bcr3剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L，所述bcr2剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：50℃ 15min 逆转录；95℃ 15min 热启动；95℃ 15s，58℃ 45s 收集荧光，45个循环。

7.一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物探针组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应液、PCR反应酶系、bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品以及阴性质控品。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品分别为含PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的目的序列的慢病毒，且浓度为1×10⁵ copies/mL；所述阴性质控品为hela细胞。