[发明专利]能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一种能特异性识别O‑GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用，属于生化检测技术领域。具体为以指数富集的配基系统进化技术(SELEX)为基础，以O‑GlcNAc修饰多肽为筛选靶标，以未修饰的多肽作为反筛。经多轮筛选后获得能够特异性识别O‑GlcNAc修饰的DNA适配体。以该适配体为核心，通过生物素等标记的DNA适配体用于检测蛋白质中O‑GlcNAc修饰水平。本发明提供了O‑GlcNAc修饰单链DNA适配体的筛选方法，生物素等标记的DNA适配体用于检测蛋白质O‑GlcNAc修饰，为O‑GlcNAc修饰的研究提供了新的方法以及为适配体在翻译后修饰中的应用开辟了新的方向，具有潜在应用前景。

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用。

背景技术

蛋白质O-GlcNAc修饰广泛存在于多种蛋白质中，是一种营养及应激反应的翻译后修饰。自发现以来已经有4000多种蛋白质被鉴定具有O-GlcNAc修饰，这些蛋白几乎参与了所有生理过程，如蛋白质结构的稳定、信号传导、调节转录活性、调节表观遗传、调节神经元功能以及蛋白质间的相互作用、应激反应等都具有非常重要的作用。蛋白O-GlcNAc修饰发生异常时，也会导致多种疾病的发生。如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病以及其它慢性疾病等都与O-GlcNAc修饰异常有关。

随着越来越多的研究，O-GlcNAc修饰的重要性不断展现出来。而研究O-GlcNAc修饰首要的方法就是要鉴定和富集出具有此种修饰的蛋白质，然而在O-GlcNAc修饰的鉴定方面却有不少困难，因为修饰不仅分子量小，丰度较低而且处于高度动态性变化中，在制备质谱样品时这种修饰极易脱落等。虽然目前有多种检测鉴定O-GlcNAc修饰的方法，但都无法满足对O-GlcNAc修饰进行大批量的鉴定研究。例如，凝集素法特异性较低，现有的O-GlcNAc修饰抗体不仅昂贵而且抗体具有氨基酸序列依赖性等等。开发新的O-GlcNAc修饰检测方法不仅是对已有方法的补充，也是更系统深入的探究O-GlcNAc修饰的需要。

指数富集配体系统进化技术(SELEX)一种体外筛选针对靶标的单链核酸分子的技术，该技术应用广泛，能筛选针对多种不同靶标。基于SELEX技术筛选出能够特异性识别O-GlcNAc修饰的ssDNA适配体不仅能够为检测O-GlcNAc修饰提供新方法，也能进一步拓宽核酸适配体的发展和应用。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种识别O-GlcNAc修饰糖肽的单链DNA核酸适配体的筛选方法。

本发明的另一目的在于提供一种识别O-GlcNAc修饰糖肽的核酸适配体。

本发明的目的还在于提供上述适配体的应用。一种蛋白质O-GlcNAc修饰水平的检测方法，方法以O-GlcNAc适配体为核心，利用生物素或荧光分子等功能集团对该适配体进行标记，用于特异性识别蛋白质中或细胞中的O-GlcNAc修饰，利用蛋白印记或免疫荧光等方法检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰水平。

具体的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体的筛选方法，其特征在于：即是基于SELEX技术筛选识别O-GlcNAc修饰的单链DNA核酸适配体的方法；包含以下步骤：

(1)用人工合成的O-GlcNAc修饰多肽，多肽N-端为半胱氨酸其氨基被乙酰基保护，具体为：

用人工合成的有O-GlcNAc修饰多肽作为SELEX的筛选靶标，多肽信息为多肽序列：CGSGGTGGSGL，其中第三位丝氨酸、第六位苏氨酸和第九位丝氨酸羟基氧原子上被N-乙酰葡萄糖胺修饰，将修饰多肽通过金巯反应连接到纳米金颗粒表面以便于将结合和未结合的适配体分离；

(2)将多肽通过金巯反应连接到纳米金颗粒表面，用于筛选过程中将结合与未结合的适配体进行固液分离，具体为：