[发明专利]一种维D及其代谢物的质谱检测用校准和质控品的制备方法

说明书

本发明涉及一种维D及其代谢物的质谱检测用校准和质控品的制备方法；其包括了空白基质制备，以及维生素D滤纸干血片校准品和质控品的制备过程；本发明制备的滤纸干血片校准品和质控品主要是应用于维生素D串联质谱法的检测，具体包括空白血基质的制备、采血量的选择，滤纸干血片校准品及质控品的制备，干血片样本量的选择，本发明提供的校准品和质控品与现有技术相比能更好满足临床检测维D干血片样本的校准和质量控制的需求。

技术领域

本发明涉及一种维生素D的检测领域，尤其涉及一种维D及其代谢物的质谱检测用校准和质控品的制备方法。

背景技术

滤纸干血片(dried blood spot，DBS)采样法，又称微量滤纸全血测定法，是使用一次性采血针或毛细管从指间或足跟采血后滴在预先规定好体积的滤纸上，即采集末梢血于滤纸片上，是一种微创采集技术。与传统的静脉采血相比，DBS采样法对样本采集者的技术要求低，血样采集的过程被简化，采血量通常小于100微升，干燥后的样本具有很好的生物稳定性，可在室温下储存和运输，更适合于婴幼儿群体的检测。目前DBS法已广泛应用在新生儿遗传疾病筛查、治疗药物监测及药动力学等领域中。随着液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)技术对分析灵敏度和重现性的不断提高，采用LC-MS/MS技术能够检测滤纸干血片样品的25-羟基维生素D含量，非常适合大规模人群样本的维生素D检测，尤其便于当地不具备检测条件的偏远地区的25-羟基维生素D检测。

现有方法需采集人体的血清样本，而婴幼儿很难采集足量血清，因此现有方法无法满足婴幼儿等特殊人群的需求。干血片法采集方便，用血量少，保存简单，易于运输，更适合于婴幼儿群体的检测。

本发明采用滤纸干血片作为载体，通过空白血基质制备，添加标准溶液后制备滤纸干血斑，得到维D干血斑的校准品和质控品，改善了校准品、质控品和临床干血斑样本的基质互通性，可更好的满足临床干血斑样本中维生素D的准确定量。

发明内容

本发明目的在于提供了一种提取率高、提取时间短的维D及其代谢物的质谱检测用校准和质控品的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种维D及其代谢物的质谱检测用校准和质控品的制备方法，包括以下步骤：

(1)空白血基质制备：

取健康人抗凝全血，离心后除去上层血浆，加入生理盐水后得到红细胞洗涤液,混匀洗涤后,离心，弃上层生理盐水，重复洗涤多次后得到红细胞，加入红细胞稀释液，混匀后得到空白血基质；

(2)制备维D滤纸干血片校准品：

精密吸取若干份2mL空白血基质，分别加入不同浓度水平的维生素D标准溶液，涡旋混匀后，得到浓度分别为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的维D校准品中间液，分别取等量体积滴加到滤纸上，待液体扩散后置于平坦干燥处过夜，干燥后即得维D滤纸干血片校准品，密封2-8℃保存；

(3)制备维D滤纸干血片质控品：

精密吸取若干份2mL空白血基质，分别加入不同浓度水平的维生素D标准溶液，涡旋混匀后，得到浓度分别为8ng/ml和40ng/ml的质控品中间液，分别取等量体积滴加到滤纸上，待液体扩散后置于平坦干燥处过夜，干燥后即得维D滤纸干血片质控品，密封2-8℃保存。

(4)维D滤纸干血片校准品和质控品的使用

进一步的，所述步骤(1)的红细胞洗涤液中生理盐水的比例为1:1或者1：2或者1：3或者1：4，所述红细胞与红细胞稀释液的比例为1:1或者1:2或者3：2，所述红细胞稀释液为含5～15％的BSA的生理盐水。

进一步的，所述步骤(1)中红细胞洗涤步骤需用滴管轻轻地反复吹吸混匀，重复洗涤次数为2-4次。