[发明专利]基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

具体包括以下步骤：

（1）根据样品中的不同动物源性成分的可能存在情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，在NCBI查找微型基因条形码对应的DNA序列，使用u-Melt软件在线拟合高分辨熔解曲线，判断是否可以达到区分目的，若可能存在的动物源性成分种类在GB/T 35918-2018所列的微型基因条形码可区分的范围内，则扩增片段长度为192bp；

（2）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解可能存在的动物源性成分对应的标准品DNA，制定高分辨熔解数据库；

（3）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解实际样品中的DNA，将其放入步骤（2）所得的标准高分辨熔解数据库中分析比对，区分和鉴别样品中动物源性成分。

2.根据权利要求1所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

所述步骤（2）中，用于扩增的引物序列为：

上游引物：

FISHCOILBC_ts：5'-CTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3'；

下游引物:

REVshort1：5'-GGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC-3'。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

所述PCR扩增体系为：5.00μL 2×Tap PCR Master Mix，1.00μL（20ng/µL） DNA模板，10μM的正向引物和反向引物各0.20μL，0.50μL 20×EvaGreen染料，最后用超纯水将反应体系补足至10.00μL；

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；执行40个循环，包括94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。

4.根据权利要求3所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

所述高分辨熔解程序为：初始温度65℃停留60s，熔解梯度为4℃/s，终止温度95℃停留1s，熔解梯度为0.05℃/s。

5.一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒，其特征在于：

包括微型基因条形码引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品的PCR扩增产物对应的高分辨熔解曲线，所述对照品选自不同动物种类的基因组DNA或对应各动物种类的基因组DNA的组合。

6.根据权利要求5所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒，其特征在于：

所述不同动物种类的基因组DNA 为山羊、绵羊、牛和水牛的基因组DNA。