[发明专利]一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

所述的RNA探针的制备方法的步骤为：1）引物设计：根据2019-nCOV待测区域碱基序列设计上游引物和下游引物，所述下游引物的5’端含有T7RNA聚合酶启动子序列；

2）构建重组质粒：将所述2019-nCOV待测区域的碱基序列插入至克隆载体中，得到带有2019-nCOV待测区域碱基序列的质粒；

3）PCR扩增：利用步骤1）所述的上游引物和下游引物扩增步骤2）得到的质粒，得到2019-nCOV待测区DNA；

4）体外转录：以所述2019-nCOV待测区DNA为模板进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义RNA探针。

2.根据权利要求1所述的RNA探针，其特征在于，步骤1）所述上游引物为COVID-19-F1，序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物为COVID-19-R2，序列如SEQ ID NO.4所示；所述2019-nCOV待测区域碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的RNA探针，其特征在于，步骤2）所述克隆载体为pGEM-T Easy载体。

4.根据权利要求1所述的RNA探针，其特征在于，步骤2）所述2019-nCOV待测区域经PCR扩增后，利用T-A克隆的方法插入到克隆载体中；PCR扩增所用的上游引物为COVID-19-F1，序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物为COVID-19-R1，序列如SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求1所述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒中的应用。

6.一种非诊断目的的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，步骤如下：

1）杂交预处理：取待测样本进行预处理；

2）预杂交：向预处理后的样本中滴加预杂交液，进行孵育；

3）杂交：将预杂交液吸干，向待测样本中滴加权利要求1所述的RNA探针，进行孵育；

4）杂交后处理：将孵育后的RNA探针回收，依次以50%甲酰胺/2×SSCT缓冲液、2×SSCT缓冲液和0.2×SSCT缓冲液漂洗待测样本；再向样本中加入阻断溶液，室温孵育；最后，加入用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体，得到杂交样本；所述的50%甲酰胺/2×SSCT缓冲液的成分为：50%甲酰胺，0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠和0.1% Tween20；

5）显色、照相：将杂交样本加入到含有终体积分数为1%的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT清洗，然后以检测缓冲液清洗；最后向其中加入AP底物染色缓冲液进行室温孵育，包裹避光，当待测样本着色出现后，用PBS清洗，显微镜观察，照相。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述预杂交液包括：50%甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、5mM EDTA，PH8.0、50μg/mL核糖体RNA、1.84% V/V 1M柠檬酸和0.1% V/VTween。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5）所述检测缓冲液，每50mL溶液中含有100mM NaCl、50mM MgCl₂、100mM 三羟甲基氨基甲烷、0.1% V/V Tween-20和1mM 左旋咪唑；所述AP底物染色缓冲液，每1mL由3.5μL NBT、3.5μL BCIP、4μL左旋咪唑和水配制而成。