[发明专利]一种虫草菌种保藏专用低温冷冻保护剂及使用方法

说明书

本发明属于真菌菌种保藏技术领域，涉及一种虫草菌种保藏专用低温冷冻保护剂及使用方法。通过菌种培养，利用光照诱导菌种形成孢子。将收集菌丝至经灭菌的研钵，加入保护剂进行研磨，并制成混悬液。保护剂由两部分组成，一部分为虫草营养液，其组成是：葡萄糖10‑20 g，蛋白胨4‑8 g，酵母浸膏1‑2 g，水定容至1000 mL，自然pH。另一部分为甘油。将两部分分别灭菌，使用前用虫草营养液配制10%‑50%甘油溶液。采用细胞筛进行过滤，收集滤液，分装至无菌的冷冻管中，密封，置于低温冷冻保藏。本发明提供的保护剂所保藏的菌种有效期在3年以上，且可直接用于液体菌种的生产，减少继代次数。

技术领域

本发明属于真菌菌种保藏技术领域，涉及一种虫草菌种保藏专用低温冷冻保护剂及使用方法。

背景技术

中国是世界上最大的食用菌生产国和出口国，食用菌产业已成为继粮食、油料、果品和蔬菜之后的第五大种植产业，最近两年我国食用菌总产量近4000万吨。尽管食用菌规模不断扩大，但我国食用菌还存在众多问题，其中最为突出是菌种问题。种源不足、菌种退化严重、制种工艺落后等等问题严重制约着产业的发展。由于传统的制种技术是通过固体菌种扩大培养进行的，其培养周期长、转接种块用量大，使得出发菌种需要经过多次的转接扩大才能投入栽培生产，本身的变异风险也迅速加大。菌种质量退化，不但会造成鲜菇口感越来越差，特有的香味减弱，甚至严重影响食用菌的产率，导致菇体畸形或失收。

蛹虫草（Cordyceps militaris）具有很高的营养价值，含丰富的氨基酸和维生素，于2009年被认定为新资源食品。蛹虫草含有其特征成分虫草素，已被证实具有显著的抗肿瘤作用。据中国食用菌协会统计，2015年蛹虫草全国产量增长高达400%，而2016年的产量受市场影响而略有下降，但其发展势头仍然十分强劲，2018年较2017年增长了13.57%。随着蛹虫草子实体生产规模的不断发展，生产模式逐渐稳定，蛹虫草作为一种新兴的食用菌种类已经被市场和广大消费者接受，并开始受到追捧，栽培企业仍在不断增加与扩大，社会经济效益非常显著。蛹虫草菌种易退化已被广泛认同，关于退化的机制也有一定的研究，但仍未找到较好的解决方法。目前，主要是尽量减少继代次数，降低退化的风险。因此，蛹虫草菌种的保藏方法是否能满足生产需要显得尤为重要。

不少虫草种类具有极高的利用价值，生物资源菌种保藏问题亟需解决。虫草属中除了名贵中药材冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的药用价值得到充分的肯定外，现代科学研究表明，虫草属其他种类也是极具应用价值的药食同源的大型真菌，如蝉花、古尼虫草（C. gunnii）、凉山虫草（C. liangshanensis）、巴恩斯虫草(C. barnesis)虫草等。目前世界上已知的虫草有500多种，我国的种类有140余种。但由于生长环境隐蔽，采集难度较大，受到种质资源收集等因素的制约，使得目前只有极小比例的种类可以人工培养。一旦获得虫草菌种，其保藏条件是影响菌种活力的重要因素。随着资源日益增多，保藏带来的工作量亦会随之增加。由于人手不足，常规转管继代的保存方法会出现培养基干涸而导致菌种死亡的问题。

综上所述，建立一种虫草专用的保藏技术是发展虫草产业的重要内容。目前菌种保藏方法主要有：定期继代转管法、石蜡保藏法、甘油保藏法、冻干法、液氮超低温保藏法等。应用最为广泛是定期继代转管法，保藏效果最佳的则是液氮超低温法。这些方法各有优缺点。目前，也有一些报道是针对蛹虫草菌种的保藏方法，但未见针对虫草类真菌菌种保藏的报道。