[发明专利]一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用

说明书

本发明提供一种具有近红外性质的His‑tag荧光探针及其制备和应用，所述近红外性质的His‑tag荧光探针可应用于His‑tag富集蛋白的标记和纯化。所述的荧光检测原理为：荧光探针的亚氨基二乙酸(IDA)可以与镍离子进行螯合。螯合后的荧光探针可以与组氨酸标签结合，使标记后的蛋白呈现红色荧光,从而可以通过蛋白质凝胶电泳分离鉴定。本发明可以为蛋白的纯化和分离提供新的思路和方法。

技术领域

本发明涉及一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用。

背景技术

蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。

固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签(His-Tag)在原核蛋白表达中的应用最为显著。

荧光探针技术是近些年来发展比较热门的标记和检测技术。由于他的灵敏性、稳定性吸引了研究者们广泛的关注。在这些荧染料中，近红外染料由于可以用于对生物损伤小、穿透性强而被广泛的应用于生物监测和应用。基于这个设想，我们设计了一种一种具有近红外性质的His-tag荧光探针的制备和应用。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用。本发明第二个目的是提供一种蛋白质纯化和鉴定的方法。

本发明为实现上述目的采用以下技术方案：

本发明提供了一种如式(III)所示的化合物，该化合物为具有近红外性质的荧光探针：

一种式(III)所示的化合物的制备方法，所述制备方法的原理为：荧光探针的亚氨基二乙酸(IDA)可以与镍离子进行螯合，螯合后的荧光探针可以与组氨酸标签结合，使标记后的蛋白呈现红色荧光,从而可以通过蛋白质凝胶电泳分离鉴定，制备方法的流程示意图如图1所示。

本发明另外提供了一种近红外His-Tag荧光探针的合成方法：

化合物(1-1)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，生成化合物(1-2)；

其中化合物(1-1)的结构如下式：

其中化合物(1-2)的结构如下式：

所述制备方法为：1.0mmol化合物罗丹明6G，1.2mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，向其中加入1.0mmol的二环己基碳二亚胺(DCC)，常温反应12小时。向反应液中加入30mL饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯(30mL)萃取三次,收集有机相，用30mL饱和氯化钠水溶液洗三次.取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以二氯甲烷你和甲醇的体积比为1:30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到化合物1-2。

一种新型近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法为：