[发明专利]检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR试剂盒及其应用在审

申请号：	202010467131.6	申请日：	2020-05-28
公开（公告）号：	CN111471801A	公开（公告）日：	2020-07-31
发明（设计）人：	吴艳涛;陈淑琴;张小荣;张成成;郭梦娇;廖凯;鄢坤	申请（专利权）人：	扬州大学
主分类号：	C12Q1/70	分类号：	C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
代理公司：	南京知识律师事务所 32207	代理人：	卢亚丽
地址：	225009 ***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	检测 tc07 传染性支气管炎病毒转录实时荧光定量 pcr 试剂盒及其应用
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【权利要求书】：

1.一种定量检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括：用于检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的探针和引物，其中上游引物TC07-2/F序列为5’-TAATCAGAGTGGGGCTCAACCT-3’(SEQ ID NO.8)；下游引物TC07-2/R序列为5’-ACCAGGAACAGCACTAATCTGTTG-3’(SEQ ID NO.9)；荧光探针TC07-2/Probe序列为5’-TCAAAAGGAACCTTCACC-3’(SEQ ID NO.10)；所述探针5’端标记荧光报告基团为6-FAM，3’端标记荧光淬灭基团为MGB。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×qPCR Probe MasterMix、ddH₂O和阳性标准品。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，阳性标准品是含有TC07-2型IBV基因片段的质粒，所述质粒是用权利要求1中所述的引物以TC07-2型IBV基因组cDNA为模板扩增的片段连接到pEasyT3载体上得到的。

4.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

(1)提取样品的RNA；

(2)标准曲线的建立

将阳性标准品质粒从10⁹拷贝/μL到10¹拷贝/μL系列稀释作为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，用于建立标准曲线；

(3)将步骤(1)中提取的RNA反转录为cDNA；

(4)以步骤(3)中的cDNA为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；

(5)PCR反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量；对数据进行处理和分析。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系为20μL，包括以下组分：0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，0.2μL荧光探针，10μL2×qPCR Probe Master Mix，2μLcDNA模板和7μL ddH₂O。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环。

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