[发明专利]一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法

说明书

本发明公开了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，通过对活性污泥样品，进行破碎，离心，得到上清液；在上清液中加入苯乙醇和十二烷基‑beta‑D‑麦芽糖苷进行反应，得到待测一氧化氮还原酶样品；在厌氧状态下，向密闭容器中加入缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯，并充入一氧化氮气体，得到酶活性反应液；在酶活性反应液中待测一氧化氮还原酶样品，震荡后，利用气相色谱法，得到一氧化氮还原酶的活性；通过对活性污泥样品的破碎、离心实现了对一氧化氮还原酶的高效提取，提取过程操作步骤简单快速；采用气相色谱法测定一氧化氮还原酶的活性，测定结果准确，高效稳定。

技术领域

本发明属于污水生物处理技术领域，特别涉及一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法。

背景技术

温室气体氧化亚氮排放问题和污泥膨胀问题是污水处理厂一直面临且急需解决的两个关键问题；污水处理厂中氧化亚氮产生途径有三种，分别为羟胺的不完全氧化、异养反硝化过程及硝化菌的反硝化过程；其中，羟胺的不完全氧化是指在氨氧化细菌的亚硝化过程中，氨态氮在跨膜蛋白氨单加氧酶的作用下，在细胞周质内生成羟胺；在羟胺被羫胺氧化酶催化氧化生成亚硝态氮的过程，会出现中间产物，如硝酰基等；在酸性条件下，该中间产物可以自发或被酶与其他化学物质，如细胞色素P₄₆₀或亚铁离子等，催化发生化学反应生成氧化亚氮；异养反硝化过程是指硝酸盐在硝酸盐还原酶，亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶的催化的作用下，依此从亚硝酸盐，一氧化氮，还原到氧化亚氮的过程；硝化菌的反硝化过程是指亚硝酸盐在亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶的催化作用下，依此从亚硝酸盐，一氧化氮，还原到氧化亚氮的过程。

污水处理系统在不同的运行条件或运行模式下，上述途径对于总氧化亚氮排放的贡献不同；如何快速识别何种途径是氧化亚氮产生的主要途径仍是一个有待解决的问题；其中，硝化菌的反硝化过程和异养反硝化过程中氧化亚氮的产生过程均与一氧化氮还原酶活性有关；通过分析一氧化氮还原酶活性与氧化亚氮的逸散情况，可以区分羟胺的不完全氧化过程和反硝化过程；通过分析该酶活性与有机物的浓度的关系，可以区分异养反硝化过程和硝化菌的反硝化过程。

引起污水处理厂中活性污泥膨胀的原因很多，氮氧化物的累积引起的污泥膨胀问题是其中重要的一种，在活性污泥内部氮氧化物会出现累积，一氧化氮还原酶活性必然较低或没有，通过分析一氧化氮还原酶活性，可以区分氮氧化物的累积引起的污泥膨胀问题和其他类型的污泥膨胀问题。

综上所述，解决上述问题的核心是测定一氧化氮还原酶的催化活性；如何高效而便捷地从活性污泥中提取一氧化氮还原酶，并测定其酶活性则是一项必不可少的工作。目前，尚无污水生物处理活性污泥中提取一氧化氮还原酶的相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，以实现高效地从活性污泥中提取一氧化氮还原酶并测定其酶活性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，包括以下步骤：

步骤1、对待测活性污泥进行离心分离，收集固体样品；采用缓冲液对固相产物进行反复冲洗；采用缓冲溶液对冲洗后的固相样品定容，至待测活性污泥的原始容积，并混合均匀，得到活性污泥样品；

步骤2、对活性污泥样品进行破碎，离心，得到上清液；在上清液中加入苯乙醇和十二烷基-beta-D-麦芽糖苷进行反应，反应结束后，离心，得到待测一氧化氮还原酶样品；

步骤3、在厌氧状态下，向密闭容器中加入缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯溶液，并充入一氧化氮气体，得到酶活性反应液；在酶活性反应液中加入步骤2中的待测一氧化氮还原酶样品，震荡后，利用气相色谱法，测定氧化亚氮的含量，进而计算得到一氧化氮还原酶的活性。