[发明专利]一种保护液及其制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种保护液及其制备方法和应用。本申请的保护液包括冻存剂和完全培养基；冻存剂由渗透性保护剂和非渗透性保护剂组成，非渗透性保护剂中含有β‑1,3葡聚糖；完全培养基由无血清基础培养基、血清替代物和左旋谷氨酰胺组成；保护液中不含胎牛血清、自体脐血血清和人血白蛋白。本申请保护液能为组织细胞提供良好冻存环境，β‑1,3葡聚糖可增加保护液稳定性，提高冻存组织保护效果和复苏后细胞活率；完全培养基，为脐带组织和细胞提供营养，与干细胞复苏与培养的培养基保持一致，增加了保护液制备和应用的便利性。本申请保护液具有使用方便、冻存制剂制备周期短、成本低、临床应用安全可靠等优点。

技术领域

本申请涉及组织细胞冻存技术领域，特别是涉及一种用于组织细胞冻存的保护液及其制备方法和应用。

背景技术

脐带是连接胎盘与胎儿的管状结构，外层为羊膜，内有2条脐动脉和1条脐静脉，在脐带内壁与脐带血管之间的胶状结缔组织为华通氏胶，即人脐带华通氏胶组织。通过培养，每1g脐带华通氏胶组织可以得到约10⁶个原代间充质干细胞。

脐带间充质干细胞属于多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，能够分化为多种细胞和组织，免疫原性低，可以分泌多种细胞因子，调节免疫系统，促进组织和器官损伤的修复，可以用于治疗骨关节炎，移植物抗宿主病、糖尿病等多种疾病；因此，脐带华通氏胶组织及脐带间充质干细胞具有广泛的临床应用前景。并且，与其他组织来源相比，选择新生儿脐带作为间充质干细胞来源有很多优点，例如含量丰富，采集过程简单，对捐赠者无损伤，而且不涉及伦理问题。

目前干细胞移植和治疗普遍使用预先储存的干细胞，即先对华通氏胶组织进行分离和原代培养，获得脐带间充质干细胞，再将其冻存以备后续使用。这种冻存方式，制备周期长、成本高，细胞培养与扩增过程会增加细胞的代次，并且冻存过程对细胞活性也会产生一定的不利影响，降低复苏后细胞培养和临床应用的稳定性。因此，也有直接对华通氏胶组织进行冻存的研究。无论是华通氏胶组织直接冻存，还是细胞分离后冻存，冻存保护液的成分都会直接影响冻存效果，影响后续使用。

现有的华通氏胶组织冻存保护液，主要包括含有胎牛血清或自体脐血血清的保护液以及含有人血白蛋白的保护液。对于含有胎牛血清或自体脐血血清的保护液，其中，胎牛血清为异种动物源，可能含有未经检测的蛋白或病毒等危险成分，会大大增加干细胞临床应用的风险；而自体脐血血清来源不能保证，采集量有限，并且血清质量会受当前身体条件等多种因素共同影响，不能确保质量稳定可靠。此外，胎牛血清与自体脐血血清都存在批次差异，无法保证质量的均一性。因此，无法保障保护液的质量和稳定性。对于含有人血白蛋白的保护液，其中，人血白蛋白为人源血液制品，为同种异体成分；当使用含有人血白蛋白的冻存保护液储存组织和细胞时，会存在传播某些病原体的潜在风险。并且，人血白蛋白同样存在批次差异，无法保证质量的均一性。而且人血白蛋白的成本高昂，不利于生产成本控制。

总的来说，现有技术存在的冻存保护液普遍含有动物血清或人血白蛋白、冻存制剂制备周期长、制备成本高、冻存复苏过程损伤细胞活性等不利于干细胞未来临床应用的诸多问题，目前行业内对更加安全可靠和低成本的细胞与组织冻存技术具有迫切的需求。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的用于组织冻存的保护液及其制备方法和应用。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种保护液，包括冻存剂和完全培养基；冻存剂由渗透性保护剂和非渗透性保护剂组成，并且，非渗透性保护剂中含有β-1,3葡聚糖；完全培养基由无血清基础培养基、血清替代物和左旋谷氨酰胺组成；并且，保护液中不含胎牛血清、自体脐血血清和人血白蛋白。