[发明专利]纳米抗体在细胞特异性捕获和细胞释放中的应用

说明书

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及纳米抗体在细胞特异性捕获和细胞释放中的应用。本发明首次将纳米抗体用于细胞特异性捕获和细胞释放。通过制备的纳米抗体定向固载表面能够高效、快速的在平面表面捕获和释放循环肿瘤细胞，克服了传统抗体捕获循环肿瘤细胞需借助微流控等提高捕获效率的弊端，且纳米抗体生产成本低，稳定性好，是替代传统抗体的最佳选择。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及纳米抗体的新应用，即在细胞特异性捕获和后续的细胞释放中的应用。

背景技术

癌症是全球最严重的致死性疾病之一，90％的癌症患者因癌症转移而死亡，癌症转移是导致癌症复发率和死亡率居高不下的主要原因。循环肿瘤细胞(Circulating tumorcells，CTCs) 是从原发病灶脱落侵袭进入外周血循环并可能在远处建立新的癌变病灶的一类癌细胞的统称。从患者血液中分离和分析CTCs不仅对了解肿瘤的发生、侵袭和转移过程具有重要的临床意义，还对癌症患者的临床诊断和术后评估有重要的指导意义。

目前CTCs的捕获方法主要有物理分离法和免疫亲和分离法两种，其中物理分离法主要是利用癌细胞的物理性质(大小、电荷、密度)与血细胞不同而分离癌细胞，该方法简单、快速、无需标记，但是缺乏特异性，捕获纯度低；免疫亲和分离法主要依靠抗体、核酸适配体、多肽等特异性识别细胞表面的蛋白标志物来分离癌细胞，是目前最常用、最有效的检测方法。在不同的免疫亲和试剂中单克隆抗体(如上皮细胞黏附因子(Epithelial celladhesion molecule，EpCAM的特异性抗体：抗EpCAM抗体)是最常用且已经商业化的，但是其分子量较大(约35kDa)限制了其在材料表面的高通量固载，通常需要结合微流控、微纳米结构基底等使用以提高捕获率，所以通常伴随着一系列设备组装、微加工技术等制备流程，过程繁琐、耗时，不利于大规模推广使用。

将捕获后的CTCs释放并进行体外培养，结合基因测序和体外药敏实验，有助于对原发性肿瘤提供个性化的治疗。目前CTCs的释放方法主要包括酶解释放、电化学解析释放、光敏诱导裂解释放、温敏释放和化学竞争触发释放，利用电化学、光敏诱导释放及温敏释放可以实现精准释放，但对材料的要求却极为严格。采用胰酶释放的方法虽然简单易行，但是选择性较差，释放的细胞纯度低，不易获得高纯度的CTCs。利用酶切释放仅适用于利用核酸适配体作为捕获试剂的体系，竞争触发释放仅适用于存在竞争作用的体系，都限制了CTCs释放的发展。基于以上的问题，需要开发一种温和、高效的CTCs释放方法。

纳米抗体(Nanobody,Nb,VHH)是一种仅由单个可变结构域(重链)组成的新型抗原结合片段，是最小的可以与抗原结合的天然抗体片段，其分子量大小为15kDa，仅为传统抗体的1/10。纳米抗体具有以下优点：1)尺寸小，可以在材料表面实现高密度固载。2)具有高特异性、耐高温及化学构象稳定，对降解和变性的抵抗力强。3)成本低，在大肠杆菌和啤酒酵母菌中易生产。纳米抗体的实际应用与传统抗体类似，但因其具有尺寸小、稳定性好、穿透性强等优势，比传统抗体的应用更加广泛，主要应用于肿瘤靶向检测和治疗、中和毒素、和构建融合分子。目前关于纳米抗体用于捕获及释放循环肿瘤细胞的研究还未见报道。

发明内容

本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，其目的在于，提供纳米抗体在细胞特异性捕获和后续的释放中的应用。

本发明提供了纳米抗体在细胞特异性捕获和后续的细胞释放中的应用。

上述技术方案中，进一步地，所述纳米抗体为特异性结合肿瘤标志物的纳米抗体。

上述技术方案中，进一步地，所述细胞为循环肿瘤细胞或干细胞。

上述技术方案中，进一步地，用于细胞特异性捕获时，将纳米抗体定向固载；用于细胞释放时，利用咪唑、乙二胺四乙酸(EDTA)释放定向固载的纳米抗体。

上述技术方案中，进一步地，所述纳米抗体定向固载的方法包括以下步骤：