[发明专利]一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法

说明书

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，具体涉及一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法。所述方法包括在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶酶基因和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的木聚糖酶基因的步骤。根据本发明，经诱导表达后同时分泌表达木聚糖酶和溶菌酶两个蛋白，通过重组木聚糖酶的活力大小来判断溶菌酶产量的高低，快速筛选高表达溶菌酶的重组菌，表达产物可以被应用于饲料添加剂。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，具体涉及一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme ,EC 3 .2 .1 .17)是一种作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，它属于碱性酶，能有效地水解致病菌中不溶性黏多糖为可溶性糖肽，其机制主要是通过水解N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)之间的β-1 ,4糖苷键，使肽聚糖骨架结构断裂后造成细胞壁破裂，最终导致细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。

溶菌酶在自然界中来源广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和动物四种类型的溶菌酶，其中动物溶菌酶活性高，应用广泛。溶菌酶的化学本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收，因此不会在体内残留且安全性很高，在食品、药品和饲料等行业具有广泛的应用前景。它在食品工业中可当作天然防腐剂，可延长肉制品、水产品、乳制品、果蔬等的储存时间；在药品领域具有抗病毒、抗感染、调节肠道菌群、止血及凝血等作用；在动物饲料工业上能提高动物的生产性能、调整动物肠道菌群、减少并替代抗生素的使用，是新型的环保饲料添加剂，同时也可以作为饲料防腐剂和杀菌剂，具有安全无毒等优点。

利用基因工程技术构建溶菌酶表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶菌酶生产技术研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供共表达的溶菌酶和木聚糖酶蛋白。

本发明的再一目的是提供一种在毕赤酵母中同时高效表达饲用溶菌酶和木聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供在毕赤酵母中同时高效表达饲用溶菌酶和木聚糖酶的工程菌。

根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶基因和核苷酸序列如SEQID NO:2所示的木聚糖酶基因的步骤。

根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括在毕赤酵母中表达核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因序列。

根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的重组表达载体，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶基因和核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的木聚糖酶基因。

根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的重组表达载体，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因序列。

在本发明的研究过程中发现，并非任意的木聚糖酶都能有效的带动溶菌酶的表达，使其免受宿主蛋白酶的攻击。因此，根据本发明的方法，为了提高融合蛋白的表达量，本发明最终确定将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的溶菌酶基因与核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示木聚糖酶基因同时表达，该木聚糖酶带动溶菌酶的表达，使溶菌酶免受宿主蛋白酶的攻击，可以直接通过表达的重组木聚糖酶的活力大小来判断溶菌酶产量的高低，同时表达产物木聚糖酶和溶菌酶可以同时直接被应用于饲料。