[发明专利]检测肝肿瘤组织豪猪音配体的方法

权利要求书

1.检测肝肿瘤组织豪猪音配体的方法，其特征在于，该方法基于适配体生物传感技术，其包括步骤：

(1)使用SELEX技术筛选并富集DNA适配体；

(2)ssDNA的克隆与测序；

(3)适配体三级结构预测及与SHh N末端蛋白模拟对接；

(4)Dot blot检测适配体与SHh结合特异性；

(5)生物层干涉法(BLI)测定结合亲和力；

(6)适配体传感器与微珠的结合；

(7)共聚焦显微镜分析微珠荧光；

(8)肝癌细胞和肝癌组织裂解物中SHh的检测；

(9)Western blot分析肝癌/癌旁组织中SHh蛋白水平；

(10)人血清样本的检测。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，利用SELEX筛选技术，从随机40个核苷酸序列(1×10¹⁵)的ssDNA文库中筛选出与SHh高亲和力特异结合的适配体；其中，筛选池的荧光强度从0.64±0.25增加59.93±6.32，在第14-16个循环后达到平台期，收获第16个周期的富集ssDNA池，并对其进行克隆和测序；从测序数据中获得针对SHh的适配体序列，命名为AP72，该序列的二级结构显示，从其5’端起具有7个碱基(14-20)与自身碱基(39-45)互补配对，形成茎环结构，两端为线性，去掉两端的线性序列，形成一个简洁的茎环结构即为适配体AP32。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，斑点杂交法鉴定两个候选适配体AP72和AP32的结合特异性；BLI技术结合亲和力分析表明，AP32和AP72与SHh的结合亲和力相似，具有很低的平衡解离常数K_D值(30nM)，适配体AP72和截短后的AP32与靶标蛋白SHh的结合能力相当，具有高亲和力的特异性结合。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述的AP32形成紧密的螺旋结构和稳定的茎环，适配体与SHh之间的相互作用主要依赖于盐桥和氢键；在对接复合物中，AP32环结构a位点的碱基dT9、dA19、dA20、dA22、dA23和dC24与SHh N末端蛋白的Arg33、Thr77、Tyr80、Asp83、Asn107和Arg34残基相互作用；AP32茎环连接处b位点的dT26和dG27碱基与SHh N末端蛋白Gly29和Gly27的氨基酸残基相互作用；AP32茎结构c位点的dT3和dT4与SHh N末端蛋白的Arg28和Pro26氨基酸残基相互作用；计算的适配体与SHh的结合自由能为-113.27±1.26kcal/mol。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法中建立基于适配体生物传感检测方法，实现复杂组分溶液中SHh的快速有效监测，其中，包括，修饰适配体适配体碱基互补，适配体AP32在5’端用TexasRed标记，在3’端用亲和素标记；合成与AP32相对应的互补单链(13个碱基)，并在其3’端标记猝灭基团BHQ2，命名为QS13；

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法中建立基于适配体生物传感检测方法，实现复杂组分溶液中SHh的快速有效监测，其中，包括，检测标准曲线分为：纳摩尔和皮摩尔水平；在0.03-62.50nM的动态范围内，SHh浓度呈线性增加，其线性方程为y＝227.1X+3468(R²＝0.9708)；当SHh浓度在pM范围内时，线性方程为y＝15.21x+35203(R²＝0.9786)；SHh的检测下限为69.02pM。

7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法中，通过蛋白印迹法分析组织样本中SHh蛋白的表达，基于适配体传感法在肝癌标本中的检测特异性为88.89％，阳性率为57.14％。当上限提高到99％置信区间时，特异度为100％，阳性率为57.14％。