[发明专利]一种诱导小麦花粉败育的方法

说明书

本发明公开了一种诱导小麦花粉败育的方法。本发明是通过将构建的具有敲除DCL5基因功能的pBUE411‑DCL5双元载体转入小麦内，沉默小麦中DCL5基因的表达，从而获得花粉败育的小麦植株。通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平DCL5基因的沉默，可直接定向诱导小麦花粉败育。

技术领域

本发明涉及一种诱导小麦花粉败育的方法，属于基因工程领域。

背景技术

花粉败育指花粉没有经过正常发育，不能起到生殖作用。花药成熟后，一般都能散放正常发育的花粉粒。由于种种内在 和外界因素的影响，有时散出的花粉没有经过正常的发育，不能起到生殖的作用，这一现象，称为花粉的败育。花粉败育的 原因是多方面的，一些情况是花粉母细胞不能正常进行减数分裂，如花粉母细胞互相粘连一起，成为细胞质块；有的出现多 极纺锤体或多核仁相连；也有产生的4个孢子大小不等，因而不能形成正常发育的花粉；有一种情况是减数分裂后花粉停留 在单核或双核阶段，不能产生精子细胞；也有因营养情况不良，以致花粉不能健全发育。绒毡层细胞的作用失常，失去应起 的作用时，也能造成花粉败育，如在花粉形成过程中，绒毡层细胞不仅没有解体，反而继续分裂，增大体积。

人工诱导花粉败育的方法通常是化学药剂诱导，但是诱导的结果并不可以明确进行控制，存在多种可能性，并不能定向 诱导。近年来，植物phasiRNA逐渐受到关注和研究，植物phasiRNA(phased,secondary,small interfering RNA)是一类内源性 的、起调控作用的非编码小RNA(s RNA)，它在植物的生长、发育、生殖以及抗病中发挥着重要作用。具有一定相位的phasiRNA (Phased small-interfering RNAs)，多数长21-nt或者24-nt。他们是由PHAS基因(phasiRNA producing genes)或者位点产生 的。在小麦幼穗和花药组织中存在大量的21-nt的phasiRNA，在不同发育时期的雄蕊组织中phasiRNA呈现动态的表达，表达高峰期出现在花粉母细胞减数分裂的前后(Zhang et al.2020)，利用相关特征我们可以开发一种新的诱导小麦花粉败育的 方法。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种诱导小麦花粉败育的方法。本发明是通过将构建的具有敲除DCL5基因 功能的pBUE411-DCL5双元载体转入小麦内，沉默小麦中DCL5基因的表达，从而获得花粉败育的小麦植株。

一种诱导小麦花粉败育的方法，具体为：降低或沉默小麦DCL5基因在小麦中的功能。

进一步的，上述方法中所述小麦TaDCL5基因在小麦中位于第二号染色体的1A，1B和1D上，分别命名为TaDCL5-1A、 TaDCL5-1B和TaDCL5-1D。

进一步的，上述TaDCL5-1A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TaDCL5-1B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， TaDCL5-1D的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，上述方法，包括如下步骤：

1)构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5；

2)用步骤1)中构建的表达载体通过农杆菌转化小麦材料，从而降低或沉默小麦TaDCL5基因在小麦中的功能，获得 花粉败育的小麦植株。

进一步的，上述步骤1)中所述的构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5的方法，包括如下步骤：

S1设计靶向TaDCL5基因的sgRNA，sgRNA对应的引物对为DCL5-gR1-TaU3-F和DCL5-gR1-TaU3-R；

S2利用步骤S1中设计的引物对，合成sgRNA的2条oligo，经过磷酸化和退火形成双链；

S3利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收载体片段；