[发明专利]湖羊MC4R基因SNP732 C→G基因SNP位点检测引物及检测试纸条和应用

权利要求书

1.湖羊MC4R基因SNPg.732C→G基因SNP位点检测引物，其特征在于，该检测引物由以下序列的引物构成：

MC4R-732-F-C：CGATCACCATCAGTGCCATCT；

MC4R-732-F-G：CGATCACCATCAGTGCCATGT；

MC4R-R：GATCAGGATGGTCAGCGTGATC。

2.根据权利要求1所述的湖羊MC4R基因SNPg.732C→G基因SNP位点检测引物，其特征在于，上游引物5游端进行BIOTIN修饰，下游引物3饰端进行FITC修饰。

3.湖羊MC4R基因SNPg.732C→G基因分型的检测试纸条，其特征在于，该检测试纸条包括权利要求1或2所述的检测引物。

4.根据权利要求3所述的检测试纸条，其特征在于，该检测试纸条还包括野生纯合型CC个体血液、野生纯合型CC个体基因组DNA、突变纯合型GG个体血液、突变纯合型GG个体基因组DNA以及以等体积双蒸水代替血液与DNA模板的阴性对照。

5.权利要求1或2所述的检测引物、权利要求3或4所述的检测试纸条在筛选湖羊体尺性状或湖羊分子标记辅助育种中的应用。

6.一种湖羊MC4R基因SNPg.732C→G基因分型的检测方法，其特征在于，该方法采用权利要求1或2所述的检测引物，包括以下的步骤：

1)MC4R-732-F-C+MC4R-R引物与野生纯合型CC个体血液模板反应；

2)MC4R-732-F-G+MC4R-R引物与突变纯合型GG个体血液模板反应，同时设置错配基因型组即MC4R-732-F-C+MC4R-R引物与突变纯合型GG个体血液模板进行反应；

3)MC4R-732-F-G+MC4R-R引物与突变纯合型CC个体血液模板进行反应；

4)待反应结束后，取4μLPCR扩增的目的产物，加入2μL 6×Loading Buffer吹吸混匀，点样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min；放入EB中染色5min，在紫外灯下观察、拍照。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤1)、2)、3)中反应体系如下：

反应条件设置如下：94℃预变性2min；98℃变性10s，退火温度选取65℃，反应时间30s，68℃延伸30s，共32个循环，4℃保存。

8.一种湖羊MC4R基因SNPg.732C→G基因分型的检测方法，其特征在于，该方法采用权利要求3或4所述的检测试纸条，包括以下的步骤：

1)使用MC4R-732-F-C+MC4R-R引物进行反应，模板分别设置为：野生纯合型CC个体血液、野生纯合型CC个体基因组DNA、突变纯合型GG个体血液、突变纯合型GG个体基因组DNA以及以等体积双蒸水代替血液与DNA模板的阴性对照；

同时使用MC4R-732-F-G+MC4R-R引物反应，模板分别设置为：野生纯合型CC个体血液、野生纯合型CC个体基因组DNA、突变纯合型GG个体血液、突变纯合型GG个体基因组DNA以及以等体积双蒸水代替血液与DNA模板的阴性对照；

2)反应结束后，打开PCR反应管，将试纸条的结合垫端插入PCR反应管，待判读区全部浸润，将试纸平放1min，等待红色条带出现；根据试纸条显色情况直接读取检测结果。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中反应体系如下：

反应条件设置如下：94℃预变性2min；98℃变性10s，退火温度选取65℃，反应时间30s，68℃延伸30s，共32个循环，4℃保存。

10.权利要求6-9任意一项权利要求所述的方法用于筛选湖羊体尺性状或湖羊分子标记辅助育种中的应用。