[发明专利]可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体

权利要求书

1.一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：其工艺包括如下步骤：

S1，蛋白QC：采购商业化蛋白；

S2，动物免疫：选取6只Balb/c小鼠进行抗原免疫，并监测其血清效价以决定最优的免疫小鼠，初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度，筛选出滴度合格的小鼠冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强至滴度最高后融合；

S3，血清检测和筛选：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度，确定其血清效价合格；

S4，融合及筛选：取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养，收集所有孔的上清，用ELISA对免疫蛋白进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清，用ELISA检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的蛋白结合，以进行亲和力排序，每个融合选免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆；

S5，亚克隆及筛选：通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，ELISA检测每个孔上清针对免疫抗原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；

S6，抗体上清制备：将最后获得的单克隆细胞株，通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产，产生的腹水用Protein A/G纯化，并用于后续检测；

S7，抗体验证：对获得的单克隆抗体细胞株进行ELISA，Western blotting，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。

2.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述S2中Balb/c小鼠为8-12周龄的Balb/c小鼠。

3.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述S3中血清效价合格线为血清效价大于10K。

4.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述S4中的融合工艺为优化过的PEG融合。

5.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述S4中4块384孔板上每孔细胞为10²～10⁴。

6.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述S7中的ELISA验证具体为：取待检测的抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，进行PBS洗涤后4℃保存待用；再进行抗原孵育，PB S洗涤，同时设置对照，加入His-HRP,TMB显色反应，酶标仪读数。

7.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述S7中的抗体芯片具体为：使用芯片点样仪将抗-CD326抗体及对照抗体点制于以NC膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点，将A375的全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时，PBS轻柔清洗三遍，再用CY3-SA荧光二抗进行孵育，PBS清洗三遍，使用GenePix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。

8.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体，其特征在于：所述的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD326的单克隆抗体可变区测序结果为：

VHF1

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS

VHCDR1

GYTFINYG

VHF2

MNWVQQAPGKGLKWMGW

VHCDR2

INTYTGEA

VHF3

TYGDDFKGRFDLSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFC

VHCDR3

VRFVNPMDY

VHF4

WGQGTSVTVSS

VLF1

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS

VLCDR1

KSVSTSGYSY

VLF2

MHWNQQKPGQPPRLLIY

VLCDR2

LVS

VLF3

NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCVLCDR3

QHIRELT

VLF4

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