[发明专利]可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体

说明书

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其为一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，包括其工艺包括如下步骤：S1，蛋白QC；S2，动物免疫；S3，血清检测和筛选；S4，融合及筛选；S5，亚克隆及筛选；S6，抗体上清制备；S7，抗体验证。本发明的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体具有高亲和力，高特异性，多应用场景等特点，并且可应用于活细胞富集。

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其是一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体。

背景技术

CD142是一种跨膜单链糖蛋白，与称为II型细胞因子受体的蛋白质家族有关。该受体家族的成员被细胞因子激活。细胞因子是可以影响白细胞行为的小蛋白。还发现VIIa与TF的结合开始细胞内的信号传导过程。TF/VIIa的信号传导功能在血管生成和细胞凋亡中发挥作用。促炎和促血管生成反应通过蛋白酶激活的受体2(PAR2)的TF/VIIa介导的裂解而激活。[8]Eph酪氨酸激酶受体(RTK)家族的EphB2和EphA2也可以被TF/VIIa裂解。CD142参与妊娠早期胎盘发育，与滋养细胞增殖分化及凋亡有关，目前市场上鲜有以CD142作为靶标载体的抗体类产品，并且都没有数据表明可以用于活肿瘤细胞富集。同时对于该研究领域缺乏有效的抗体工具。

发明内容

本发明的目的为提供一个靶向蛋白研究的工具，对不同癌症患者、癌症不同分期的蛋白表达变化及蛋白网络图谱的更深层次研究得以实现。

本发明采用的技术方案如下：一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其工艺包括如下步骤：

S1，蛋白QC：采购商业化蛋白；

S2，动物免疫：选取6只Balb/c小鼠进行抗原免疫，并监测其血清效价以决定最优的免疫小鼠，初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度，筛选出滴度合格的小鼠冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强至滴度最高后融合；

S3，血清检测和筛选：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度，确定其血清效价合格；

S4，融合及筛选：取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养，收集所有孔的上清，用ELISA对免疫蛋白进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清，用ELISA检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的蛋白结合，以进行亲和力排序，每个融合选免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆；

S5，亚克隆及筛选：通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，ELISA检测每个孔上清针对免疫抗原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；

S6，抗体上清制备：将最后获得的单克隆细胞株，通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产，产生的腹水用Protein A/G纯化，并用于后续检测；

S7，抗体验证：对获得的单克隆抗体细胞株进行ELISA，Western blotting，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。

作为本发明的一种优选技术方案：所述S2中Balb/c小鼠为8-12周龄的Balb/c小鼠。

作为本发明的一种优选技术方案：所述S3中血清效价合格线为血清效价大于10K。

作为本发明的一种优选技术方案：所述S4中的融合工艺为优化过的PEG融合。