[发明专利]源于里氏木霉的还原酶及其编码基因和用途

权利要求书

1.酶，其特征在于，所述酶具有ε-N-(l戊二酸基2)-L-赖氨酸还原酶的活性，所述ε-N-(l戊二酸基2)-L-赖氨酸还原酶的活性在二氨基庚二酸途径中提供催化6-氧-DL-己氨酸形成ε-N-(l戊二酸基2)-L-赖氨酸的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有ε-N-(l戊二酸基2)-L-赖氨酸还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1所述的酶。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为如下(c)、(d)、(e)或(f)的碱基序列：

(c)如SEQ ID NO:1所示；

(d)如SEQ ID NO:2所示；

(e)编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(f)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有ε-N-(l戊二酸基2)-L-赖氨酸还原酶功能的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。

5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的DNA分子或权利要求4所述的重组载体。

6.一种赖氨酸营养缺陷型突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、以野生型里氏木霉基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:6和如SEQ ID NO:7所示的引物对进行PCR扩增得到TrLys9基因的上游片段，利用如SEQ ID NO:8和如SEQ ID NO:9所示的引物对进行PCR扩增得到TrLys9基因的下游片段，并先后将所述上游片段和下游片段连接到pBS-HPH载体上，获得TrLys9基因敲除载体；

步骤二、将步骤一中得到的TrLys9基因敲除载体通过原生质体转化方法转化入宿主细胞内，筛选得到赖氨酸营养缺陷型突变体。

7.如权利要求6所述的赖氨酸营养缺陷型突变体的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，将扩增得到的所述上游片段采用Kpn I和Sal I限制性内切酶双酶切位点，将双酶切后的上游片段连到用同样酶切位点的pBS-HPH上；

将扩增得到的所述下游片段连接到T载体上，然后采用Hind III和Xba I限制性内切酶双酶切位点，同时用Hind III和Xba I酶切上述连接所述上游片段的pBS-HPH载体，将T载体酶切后的下游片段连到同样酶切位点的pBS-HPH上，构建好所述TrLys9基因敲除载体。

8.如权利要求6所述的赖氨酸营养缺陷型突变体的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，所述筛选包括如下步骤：涂布到含有潮霉素B抗性的CM平板上，培养得到转化子，并挑出转化子培养后利用如SEQ ID NO:10和如SEQ ID NO:11的引物对进行PCR扩增，未出现扩增条带的转化子即为所述赖氨酸营养缺陷型突变体。

9.权利要求2所述的DNA分子作为赖氨酸的营养缺陷型标记基因的用途。

10.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的DNA分子在里氏木霉生长发育中及实际生产优化中的用途。