[发明专利]一种柱式法从细胞中分离总膜的方法

说明书

本发明公开了一种柱式法从细胞中分离总膜的方法，包括以下步骤：在低渗缓冲液或等渗缓冲液中孵育动植物细胞，使其对机械破坏敏感，形成细胞混合物；通过施加正向力或者负向力，使所述细胞混合物通过含有多孔过滤介质的过滤装置，细胞膜迅速破裂，同时保留大多数细胞核和其他细胞器；细胞器、细胞核和可溶性细胞质蛋白，以及破裂的细胞膜穿过过滤装置形成滤液，而聚集的细胞和/或组织碎片则被截留在过滤装置中；通过差速离心使所述滤液中存在的细胞膜和细胞器与可溶性胞质蛋白和细胞核进一步分离得到细胞总膜，即细胞膜和细胞器，整个过程仅需要一次孵育，不到30分钟即可完成，同时无需去污剂不会改变膜的正常构象，整个方法简单，易于实现。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种柱式法从细胞中分离总膜的方法。

背景技术

从动植物细胞和/或组织中分离细胞总膜，是进一步纯化和鉴定细胞膜和细胞器蛋白质的第一步。超过70％的药物靶标和生物标志物存在于细胞膜上，因此膜蛋白的分离和纯化是生物医学研究中最常用的方法之一。

传统的细胞膜和细胞器分离方案通常涉及在低渗缓冲液或含有去污剂的缓冲液(例如Triton-X 114)中匀浆培养的细胞和/或组织。用玻璃匀浆器(例如Dounce匀浆器)匀浆细胞和/或组织，超声处理或组织研磨仪破碎细胞和/或组织。通过差速离心将细胞膜和细胞器与细胞核和其他可溶性蛋白分离。程序繁琐且耗时，一个典型的过程需要一个多小时才能完成。

目前，有几种商业试剂盒可用于分离膜蛋白。根据细胞膜破坏的机理，这些商业试剂盒可大致分为两类：一种是使用去污剂(例如Mem-PER真核膜蛋白提取试剂盒)分离膜蛋白，而无需使用玻璃均浆器。另一种是使用玻璃均浆器(例如Biovison的质膜蛋白提取试剂盒和Abcam的质膜蛋白提取试剂盒)或研磨仪(例如无需使用去污剂的细胞膜和核膜蛋白提取方案)。

但是这两种方法均有缺点：使用去污剂进行膜蛋白分离改变了细胞膜和膜蛋白的正常构型。使用玻璃均浆器或研磨仪进行膜破坏的方法通常需要大量的起始细胞(5×10⁶及以上)。对于多个样品，玻璃均浆器和组织研磨仪的使用不够便利，用户体验感差并且很耗时。每个样品都需要彻底清洗均浆器，并且有样品交叉污染的可能性。另外，当前可用的用于细胞膜和细胞器分离的商业试剂盒相对繁琐且耗时。除了使用玻璃均浆器或组织研磨仪外，还需要进行多个孵育和离心步骤，这些过程耗时长。

有鉴于此，急需对现有的从细胞中分离总膜的方法进行改进，实现利用过滤装置分离细胞总膜，使细胞总膜便于提取并且提取的细胞总膜保持天然构象且缩短分离细胞总膜需要的时间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的从细胞中分离总膜的方法用时过长的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种柱式法从细胞中分离总膜的方法，包括以下步骤：

在低渗缓冲液或等渗缓冲液中孵育动植物细胞，使其对机械破坏敏感，形成细胞混合物；

通过施加正向力或者负向力，使所述细胞混合物通过含有多孔过滤介质的过滤装置，动植物细胞的细胞膜会迅速破裂，同时保留大多数细胞核和其他细胞器；细胞器、细胞核和可溶性细胞质蛋白，以及破裂的细胞膜穿过所述过滤装置形成滤液，而聚集的细胞和/或组织碎片则被截留在所述过滤装置中；

通过差速离心使所述滤液中存在的细胞膜和细胞器与可溶性胞质蛋白和细胞核进一步分离得到细胞总膜，即细胞膜和细胞器；

所述多孔过滤介质设置在所述过滤装置的内腔底部，具有30μm的平均孔径，厚度0.1mm，用于截留聚集的细胞和/或组织碎片，以及用于使被所述低渗或等渗缓冲剂溶胀处理的所述动植物细胞通过时破裂。

在上述方法中，所述过滤介质由疏水性材料制成，或者由亲水性材料制成。

在上述方法中，所述过滤介质的孔径为20～60μm。