[发明专利]检测HBV的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法，其特征在于：以金属有机骨架材料MIL-101为载体，病毒适体作为功能单体之一进行分子印迹，形成适体-分子印迹聚合物双重识别体系，印迹过程中加入了荧光染料罗丹明B，在分子印迹聚合物与目标物结合后，印迹腔内的荧光染料荧光强度发生变化，而MIL-101材料的荧光强度几乎不变，基于此构建了所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器；

所述制备方法包括如下步骤：

1)MIL-101-NH₂的制备及纯化：将800mg Cr(NO)₃·9H₂O、360mg NH₂BDC和159.02mg NaOH加入15mL水中搅拌1小时，然后将溶液转移到聚四氟乙烯基反应器中，150℃下反应12小时，随后自然冷却至室温得到绿色悬浮液，用DMF溶剂清洗该绿色悬浮液进行粗提纯，再将粗提纯产物分散在25mL的乙醇中并置于烤箱中，在90℃下反应6小时后取出，即得到纯MIL-101-NH₂；

2)MIL-101-Apt的制备：首先，在250μL 1μM HBV适体中加入1M EDC和0.25M NHS各125μL，室温下振荡1小时得到活化的HBV适体，然后将100mg MIL-101-NH₂分散在4.5mL的pH＝7.4，的PBS缓冲液中，添加上述活化的HBV适体在37℃振荡过夜，最后将所得的MIL-101-Apt材料用PBS溶液洗涤3次以上以除去未结合的适体，直到上清液中检测不到适体的紫外吸收；

3)印迹聚合物(MIP)的制备：首先，将0.0048g罗丹明B与EDC/NHS，以4:1形式混合，溶于4mL超纯水中超声15s，然后在37℃振荡1h以活化罗丹明B，然后将30mg MIL-101-Apt和0.4mL模板病毒HBV在37℃下孵育1h，随后将其分散在10mL超纯水中并在强烈搅拌下加入10μL APTES，降低转速反应0.5h后加入上述活化的罗丹明B，反应5h后，添加交联剂TEOS和NH₃·H₂O各20μL聚合12h得到含HBV的印迹聚合物，用超纯水洗涤该产物多次以除去未反应的单体和病毒，最后，用0.1M含10％SDS的HAc多次洗涤除去模板病毒，直到洗脱液检测不到HBV的紫外吸收，根据相同的方法制备非印迹聚合物(NIP)，但不添加模板病毒；

4)所述分子印迹比率型荧光传感器的制备：通过超声将MIP分散在PBS缓冲液中，取200μL于比色皿中检测该溶液的荧光，随后加入不同浓度的HBV溶液，恒温振荡一段时间后，取200μL溶液于比色皿中检测荧光，并记录添加病毒前后在相同发射下的荧光强度差ΔF，采用RF-5301PC荧光分光光度计检测荧光，构建成一种分子印迹比率型荧光传感器；

所述分子印迹比率型荧光传感器的检测条件为：激发波长290nm和550nm，发射波长460nm和570nm，激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：5.0nm。

2.根据权利要求1所述制备方法制备得到的双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器的应用，其特征在于：用所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器对不同浓度HBV溶液进行分析，以评估其对目标病毒的检测范围和检测限；或用所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器检测相同浓度的不同病毒，以评估其对目标病毒的选择性识别与检测能力；或将所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器用于人血清中HBV加标回收，以评估其对HBV的实际分析能力。