[发明专利]一种牛支原体Mbov_0570基因突变株及其应用

说明书

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0570基因突变株，属于动物传染病防治技术领域，所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.171，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020083，所述Mbov_0570基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明通过qRT‑PCR检测T9.171株刺激BoMac细胞表达IL‑8的能力，显示该突变株诱导BoMac细胞表达细胞因子的能力下降，提示突变株毒力下降，可望作为疫苗株在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一株牛支原体Mbov_0570基因突变株，该突变株诱导巨噬细胞表达IL-8细胞因子的能力降低，在制备牛支原体疫苗方面具有较好的应用潜力。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种危害养牛业发展的重要病原，在世界范围内广泛存在，可以感染任何年龄段的牛，其发病多与运输应激相关，多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎，犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加，牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题，而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发，进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。

申请人利用含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体构建牛支原体Mbov_0570基因突变株，并通过与牛巨噬细胞互作研究证明，巨噬细胞表达IL-8的能力降低，可望将突变株运用于牛支原体免疫防治领域，同时还有助于揭示牛支原体毒力机制和免疫制剂的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一株牛支原体Mbov_0570基因突变株，该突变株相比野生株HB0801诱导巨噬细胞表达IL-8炎性细胞因子的能力降低，可望作为减毒株在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

申请人利用牛支原体HB0801株(GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标记，成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选，最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0570基因突变株，该突变株的突变基因为Mbov_0570，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中的1-2265位碱基所示的序列，长度为2265bp，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共编码754个氨基酸。转座子插入位点位于基因组672416位点后，位于Mbov_0570基因的409位点后，并通过Western blot验证了突变株MbovP0570的缺陷表达。

申请人将该突变株命名为牛支原体T9.171，Mycoplasma bovis T9.171，于2020年4月27日保藏在湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020083。最后，使用qRT-PCR技术检测突变株感染牛巨噬细胞后细胞因子的表达量，实验结果显示T9.171菌株相比野生株HB0801和传代致弱株诱导巨噬细胞表达IL-8的能力均降低，提示其是一种毒力致弱株，有作为疫苗株开发应用的潜力。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：Mbov_0570基因序列中转座子插入突变位点。图中：方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。

图2：T9.171突变株刺激BoMac表达IL-8的检测结果。图中：****p0.001；*p0.05；DS p0.05。

具体实施方式

实施例1：牛支原体插入突变体库的构建