[发明专利]一种牛支原体Mbov_0475基因突变株及其应用

说明书

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0475基因突变株，属于动物传染病防治技术领域，所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.55，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020082，所述Mbov_0475基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。该菌株具有诱导巨噬细胞增殖和提高巨噬细胞活力的作用，鉴于牛巨噬细胞是宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，该突变株可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体Mbov_0475基因突变株。该突变株能诱导巨噬细胞增殖和提高巨噬细胞活力。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种危害养牛业发展的重要病原，在世界范围内广泛存在，可以感染任何年龄段的牛，其发病多与运输应激相关，多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎，犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加，牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题，而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发，进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。

申请人利用含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体构建了牛支原体Mbov_0475基因突变株，并通过其与牛巨噬细胞互作研究证实该突变体能诱导牛巨噬细胞增殖并提高巨噬细胞活力，从而可望运用于牛支原体免疫防治领域，同时还有助于揭示牛支原体毒力机制和免疫制剂的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一株牛支原体Mbov_0475基因突变株，该菌株能诱导宿主巨噬细胞增殖并提高巨噬细胞活力，从而可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

为了实现本发明的目的，申请人从牛支原体突变体库中筛选得到Mbov_0475基因突变体T9.55菌株，通过实验验证该突变株相比野生株和回补株诱导牛巨噬细胞增殖的能力变强，且感染巨噬细胞的活力增加，而牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，因此推测T9.55可望成为牛支原体新型疫苗候选菌株，在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人以牛支原体HB0801为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标记，成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选，最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0475基因突变株，该突变株的突变基因为Mbov_0475，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中的1-1107位碱基所示的序列，长度为1107bp，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共编码368个氨基酸。转座子插入位点位于基因组555965位点后，位于Mbov_0475基因的555位点后。并通过Western blot验证了突变株MbovP0475的缺陷表达。

申请人将该突变菌株命名为牛支原体T9.55，Mycoplasma bovis T9.55，于2020年4月27日保藏于中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020082。

接着，申请人通过检测MbovP475缺失/回补菌株及野生株HB0801感染牛巨噬细胞后的细胞周期、细胞增殖、细胞活力，具体方法如下：

1)牛支原体MbovP475回补株的构建：