[发明专利]一种牛支原体Mbov_0280基因突变株及其应用

说明书

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0280基因突变株，属于动物传染病防治技术领域，所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.297，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020085，所述Mbov_0280基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。该菌株相比野生菌株HB0801诱导宿主巨噬细胞凋亡的能力减弱，鉴于牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，该突变株具有更低的毒力，同时有助于机体抵抗牛支原体感染，从而可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体Mbov_0280基因突变株，该突变株诱导巨噬细胞凋亡的能力降低。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种危害养牛业发展的重要病原，在世界范围内广泛存在，可以感染任何年龄段的牛，其发病多与运输应激相关，多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎，犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加，牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题，而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发，进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。

申请人利用含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体，构建了牛支原体Mbov_0280基因突变株，并通过与牛巨噬细胞互作研究证实，该突变株诱导巨噬细胞凋亡能力降低，提示具有更低的毒力，同时有助于机体抵抗牛支原体感染，有望运用于牛支原体免疫防治领域，同时还有助于揭示牛支原体毒力机制和免疫制剂的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体Mbov_0280基因突变株，该菌株诱导巨噬细胞凋亡的能力减弱，鉴于牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，因此该突变株可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

基本思路是，申请人以牛支原体HB0801株(GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标记，成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选，最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0280基因突变株，该突变株的突变基因为Mbov_0280，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中的1-1020位碱基所示的序列，长度为1020bp，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共编码339个氨基酸。转座子插入位点位于基因组323270位点后，位于Mbov_0280基因的888位点后。并通过Western blot验证了突变株MbovP0280的表达缺陷。

申请人将该突变株命名为牛支原体T9.297(Mycoplasma bovis T9.297)，于2020年4月27日保藏在湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020085。最后，将该突变菌株T9.297与野生株HB0801分别接种于PPLO培养基中，进行生长曲线检测，结果显示二者生长速度无差异，利用Annexin-FITC/PI流式分析T9.297突变株和野生株HB0801株引起牛巨噬细胞凋亡的能力，结果发现，相比HB0801株，T9.297突变株引起BoMac细胞凋亡的能力下降。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：Mbov_0280基因序列中转座子插入突变位点。图中：方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。

图2：Western blot鉴定T9.297突变株缺失表达MbovP280。

图3：T9.297突变株在PPLO培养基中生长曲线。