[发明专利]用于提取金黄色葡萄球菌总DNA的方法及试剂盒在审
申请号: | 202010494680.2 | 申请日: | 2020-06-03 |
公开(公告)号: | CN111440849A | 公开(公告)日: | 2020-07-24 |
发明(设计)人: | 聂子梅;黄非;宋乐元;田润 | 申请(专利权)人: | 成都正能生物技术有限责任公司 |
主分类号: | C12Q1/6806 | 分类号: | C12Q1/6806;C12N15/81;C12N15/62;C12R1/445;C12R1/865 |
代理公司: | 北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129 | 代理人: | 刘丹 |
地址: | 610015 四川省成都市双流区西南*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 提取 金黄色 葡萄球菌 dna 方法 试剂盒 | ||
1.一种金黄色葡萄球菌总DNA提取方法,包括:培养金黄色葡萄球菌并收集菌体,其特征在于:
(1)用反应缓冲液重悬菌体,然后加入由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶,37℃温育15-60min;
(2)加入核酸释放缓冲液,混匀后室温放置10-15min,得反应物;
(3)将反应物转移至核酸结合柱中,离心,弃滤出液;
(4)向结合柱中加入核酸清洗液,离心,弃滤出液,晾干结合柱;
(5)将结合柱放入洁净的离心管中,加入无菌蒸馏水,待DNA溶解后离心,得金黄色葡萄球菌总DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤:在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列,C端添加酶蛋白稳定性序列,得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列;合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体,然后转化酿酒酵母菌,得到重组酿酒酵母菌;培养重组酿酒酵母菌,诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示,所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示,所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示;优选地,所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述反应缓冲液包含如下组分:15-30mMpH 7.0-8.0Tris-Cl,0.5%-1.2%g/ml NaCl,0.05%-0.1%g/ml N-月桂酰肌氨酸钠。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述反应缓冲液的配方为:20mMpH7.4Tris-Cl,0.9%g/ml NaCl,0.05%g/ml N-月桂酰肌氨酸钠。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述核酸释放缓冲液为4M GuSCN;所述核酸清洗液的配方为:10mM pH8.0 Tris-Cl,150mM NaCl,70%乙醇。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于:每毫升金黄色葡萄球菌培养液收集的菌体使用400μL反应缓冲液、10μL溶葡球菌酶溶液和400μL核酸释放缓冲液;所述溶葡球菌酶溶液的浓度为1mg/mL,纯度90%。
8.一种金黄色葡萄球菌总DNA提取试剂盒,其特征在于:包括反应缓冲液以及由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶;所述反应缓冲液包含如下组分:15-30mM pH 7.0-8.0Tris-Cl,0.5%-1.2%g/ml NaCl,0.05%-0.1%g/ml N-月桂酰肌氨酸钠。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于:所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤:在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列,C端添加酶蛋白稳定性序列,得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列;合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体,然后转化酿酒酵母菌,得到重组酿酒酵母菌;培养重组酿酒酵母菌,诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示,所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示,所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示;优选地,所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
11.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于:还包括核酸释放缓冲液和核酸清洗液;所述核酸释放缓冲液为4M GuSCN;所述核酸清洗液的配方为:10mM pH8.0 Tris-Cl,150mMNaCl,70%乙醇。
12.根据权利要求8-11任一所述的试剂盒,其特征在于:所述反应缓冲液的配方为:20mM pH7.4 Tris-Cl,0.9%g/ml NaCl,0.05%g/ml N-月桂酰肌氨酸钠;所述溶葡球菌酶的纯度90%。
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