[发明专利]用于提取金黄色葡萄球菌总DNA的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌总DNA提取方法，包括：培养金黄色葡萄球菌并收集菌体，其特征在于：

(1)用反应缓冲液重悬菌体，然后加入由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶，37℃温育15-60min；

(2)加入核酸释放缓冲液，混匀后室温放置10-15min，得反应物；

(3)将反应物转移至核酸结合柱中，离心，弃滤出液；

(4)向结合柱中加入核酸清洗液，离心，弃滤出液，晾干结合柱；

(5)将结合柱放入洁净的离心管中，加入无菌蒸馏水，待DNA溶解后离心，得金黄色葡萄球菌总DNA溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤：在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列，C端添加酶蛋白稳定性序列，得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列；合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体，然后转化酿酒酵母菌，得到重组酿酒酵母菌；培养重组酿酒酵母菌，诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示，所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应缓冲液包含如下组分：15-30mMpH 7.0-8.0Tris-Cl，0.5％-1.2％g/ml NaCl，0.05％-0.1％g/ml N-月桂酰肌氨酸钠。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述反应缓冲液的配方为：20mMpH7.4Tris-Cl，0.9％g/ml NaCl，0.05％g/ml N-月桂酰肌氨酸钠。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸释放缓冲液为4M GuSCN；所述核酸清洗液的配方为：10mM pH8.0 Tris-Cl，150mM NaCl，70％乙醇。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：每毫升金黄色葡萄球菌培养液收集的菌体使用400μL反应缓冲液、10μL溶葡球菌酶溶液和400μL核酸释放缓冲液；所述溶葡球菌酶溶液的浓度为1mg/mL，纯度90％。

8.一种金黄色葡萄球菌总DNA提取试剂盒，其特征在于：包括反应缓冲液以及由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶；所述反应缓冲液包含如下组分：15-30mM pH 7.0-8.0Tris-Cl，0.5％-1.2％g/ml NaCl，0.05％-0.1％g/ml N-月桂酰肌氨酸钠。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤：在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列，C端添加酶蛋白稳定性序列，得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列；合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体，然后转化酿酒酵母菌，得到重组酿酒酵母菌；培养重组酿酒酵母菌，诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示，所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：还包括核酸释放缓冲液和核酸清洗液；所述核酸释放缓冲液为4M GuSCN；所述核酸清洗液的配方为：10mM pH8.0 Tris-Cl，150mMNaCl，70％乙醇。

12.根据权利要求8-11任一所述的试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液的配方为：20mM pH7.4 Tris-Cl，0.9％g/ml NaCl，0.05％g/ml N-月桂酰肌氨酸钠；所述溶葡球菌酶的纯度90％。