[发明专利]一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法，其特征在于，具体方法为：

1)提取DNA模板；

2)PCR扩增；

3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，测序；

4)使用EditSeq软件，输入测序结果，利用查找功能查找测序结果中所有VNTR重复序列，获得VNTR重复次数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中提取DNA模板具体为：

将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化，经高压灭菌锅121℃45min高温灭活，13000转/min离心10mim后的上清，即得DNA模板。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中提取DNA模板具体为：将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化，经高压灭菌锅121℃45min高温灭活，13000转/min离心10mim后，沉淀使用提取试剂盒，得到DNA模板。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增，分别扩增MIRU-20位点、MIRU-40位点、Mtub-04位点和Mtub-21位点，扩增上述位点所用引物分别为：

MIRU-20 F:5’-TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG-3’；如SEQ ID No.1所示；

MIRU-20 R:5’-GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA-3’；如SEQ ID No.2所示；

MIRU-40 F:5’-CCCGCCTTCGAAACGTCGCT-3’；如SEQ ID No.4所示；

MIRU-40 R:5’-TGGACATAGGCGACCAGGCGAATA-3’；如SEQ ID No.5所示；

Mtub-04 F:5’-GTCCAGGTTGCAAGAGATGG-3’；如SEQ ID No.7所示；

Mtub-04 R:5’-GGCATCCTCAACAACGGTAG-3’；如SEQ ID No.8所示；

Mtub-21 F:5’-AGATCCCAGTTGTCGTCGTC-3’；如SEQ ID No.10所示；

Mtub-21 R:5’-CAACATCGCCTGGTTCTGTA-3’，如SEQ ID No.11所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增，条件为：98℃变性10sec、50℃退火30sec、72℃延伸1min，这3个步骤40个循环，最后72℃5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为：打开EditSeq软件，将VNTR目的基因测序结果输入，点击Ctrl+F，将对应VNTR重复序列输入对话框内，再点击FindNext，直至找出所有VNTR重复序列，直接获得VNTR重复次数，即获得基因拷贝数。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，MIRU-20位点的重复序列长度的大小为77bp，重复单元序列如SEQ ID No.3所示。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，MIRU-40位点的重复序列长度的大小为54bp；重复单元序列如SEQ ID No.6所示。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Mtub-04位点的重复序列长度的大小为51bp；重复单元序列如SEQ ID No.9所示。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Mtub-21位点的重复序列长度的大小为57bp，重复单元序列如SEQ ID No.12所示。