[发明专利]一种生产MK-7的基因工程菌及方法、应用

说明书

本发明公开一种生产MK‑7的基因工程菌以及利用该基因工程菌生产MK‑7的方法，公开了一种提高MK‑7发酵产量的方法，公开了该基因工程菌株的应用。将菌株基因组上的四异戊二烯基‑β‑姜黄烯合成酶基因缺失，或者四异戊二烯基‑β‑姜黄烯合成酶失活或者活力降低，可将MK‑7发酵产量提高10倍左右。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因工程菌及其发酵生产MK-7的方法，一种提高MK-7发酵产量的方法，利用该基因工程菌在含有MK-7的饲料、食品、保健品或者药品中的应用。

背景技术

维生素K2是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一，可预防骨质疏松症和心血管疾病。众所周知，补钙的关键是钙能否被骨骼吸收，如果骨骼不能吸收的话，补充的钙可能会造成血钙浓度提高，甚至引起血管钙化和动脉粥样硬化。维生素K2能够支持骨骼健康和心血管健康的原因是，可以促进血液中的钙，进入骨骼，一方面增加了骨骼钙化，另一方面降低了血液中的钙浓度；起到这一作用的机理是维生素K2可以活化骨钙素(OC)和基质γ-羧基谷氨酸蛋白(MGP)，使其形成“钙爪”，促进钙吸收入骨。中国国家卫计委已批准维生素K2为营养强化剂，这推动了维生素K2的市场化，目前除了保健食品以外，一些普通食品(如酸奶、牛奶等)、动物饲料等也选择强化维生素K2。

维生素K2的结构是一系列含有2-甲基-1,4-萘醌母核及C3位带有数目不等的异戊二烯结构单元的萜烯侧链。根据萜烯侧链上异戊二烯结构单元的数目，维生素K2可分为不同类型，目前已经商业化的维生素K2分别是含有4个异戊二烯结构单元的MK-4和7个异戊二烯结构单元的MK-7(Menaquinone-7)。无论从生物活性、生物利用度还是功效方面，MK-7都远超MK-4，具有更广阔的市场前景。

目前MK-7的生产主要通过化学合成和发酵，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，如纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)。但化学合成收率低，污染严重；纳豆枯草芽孢杆菌在发酵罐中的MK-7发酵单位只有300mg/L，因此利用纳豆枯草芽孢杆菌生产大量MK-7也不现实；无论上面哪种方法生产MK-7，成本巨大。已有文献报道在芽孢杆菌中利用基因工程手段来提高MK-7的产量，文献Yang,et al.Modular pathwayengineering of Bacillus subtilis to promote de novo biosynthesis ofmenaquinone-7.ACS Synth.Biol.8(1),70-81,2019中，在Bacillus subtilis 168中敲除异分支酸酶(dhbB)，过表达1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)、1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因(dxr)等用于MK-7的生产；文献Ma,et al.Metabolic Engineering of theMEP Pathway in Bacillus subtilis for Increased Biosynthesis of Menaquinone-7.ACS Synth.Biol.8(7),1620-1630,2019中，在B.subtilis 168中过表达dxs、dxr等用于MK-7的生产。目前尚无相关文献报道，敲除ytpB基因，可提高MK-7发酵产量。

发明内容

基于背景技术存在的技术现状，本发明公开了一种基因工程菌及其生产MK-7的方法，提高MK-7产量的方法，本发明将菌株中的四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因缺失，或者四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶失活或者活力降低，可以使得七异戊二烯焦磷酸(heptaprenyldiphosphate)到四异戊二烯基-β-姜黄烯的代谢流截断或者减弱。

优选地，所述菌株为芽孢杆菌、类芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、棒杆菌。