[发明专利]生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产NMN的方法

说明书

本发明提供了一种生产β‑烟酰胺单核苷酸（NMN）的重组微生物，以及利用该重组微生物生产NMN的方法，所述重组微生物菌种含有一个或几个下列特征或全部特征，这些特征是：（1）在发酵培养基中添加烟酰胺经由重组微生物转化生成NMN；（2）过表达了烟酰胺磷酸核糖转移酶。（3）重组微生物基因组上编码碱性磷酸酶、核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种或多种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物构建，以及利用重组微生物生产β-烟酰胺单核苷酸。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN CAS:1094-61-7)是一种自然存在的生物活性核苷酸，有α和β2种不规则存在形式；而β-异构体是NMN的活性形式，分子式C11H15N2O8P，分子量334.22。它含有一分子烟酰胺组分，因为烟酰胺属于维生素B3，因此NMN也被归纳到维生素B族衍生物，它是在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，EC 2.4.2.12)催化下，由烟酰胺(Nam)与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应的产物，同时是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的关键前体。哺乳动物体内的NAD+经由细胞内的各种酶生成NMN和Nam，在NAD+供应不足时，细胞会重新利用NMN和Nam来合成NAD+。Nam在Nampt的催化下生成NMN，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)的催化下生成NAD+，即NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。

近期的研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用，因此，NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。

NMN的体外制备方法分为化学合成，半酶法合成和全酶法合成，其中以化学合成为主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应；这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题；半酶法合成是利用化学合成制备烟酰胺核糖，再利用烟酰胺核糖激酶和外源的ATP合成NMN；全酶法则是利用烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺，磷酸核糖焦磷酸和ATP直接合成NMN。采用Nampt催化Nam生成NMN，不仅需要酶法合成磷酸核糖焦磷酸，整个合成中需要大量昂贵的ATP，而且由于现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的酶活性较低，使得酶法反应存在耗时长、成本高、收率低等问题，难以实现工厂化大规模生产，因此限制了NMN的大规模应用。

生物发酵法生产NMN，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NMN，克服酶法生产中的限制因素，其优势在于以糖质为原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低。

发明内容

本发明的目的是利用基因工程手段构建具有高产NMN的生物合成和积累能力的重组微生物，从而在菌种发酵过程中生产大量NMN，达到绿色环保低成本的NMN生产。

技术方案

本发明的技术方案可以应用大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌(Bacillus)，乳酸杆菌(Lactococcus)，棒杆菌(Corynebacteria)，酿酒酵母(Saccharomyces)，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。