[发明专利]一种生产尿苷的重组微生物及生产尿苷的方法

说明书

本发明提供了一种生产尿苷的重组微生物以及利用该重组微生物生产尿苷的方法。其中，对尿苷的降解及利用基因进行了敲除，这些基因编码核糖核苷水解酶，尿苷磷酸化酶，核苷磷酸化酶，胞苷/尿苷激酶以及核苷转运蛋白。同时，对尿苷生物合成途径中的关键酶进行了过表达，包括降解胞苷三磷酸到胞苷单磷酸的胞苷三磷酸焦磷酸化酶，以及催化尿苷单磷酸到尿苷的尿苷单磷酸磷酸化酶。此外，对嘧啶核苷途径进行了基因工程改造，解除合成途径的反馈抑制。通过生物发酵方法将重组菌株在5升发酵罐可达到20g/L以上的尿苷产量，可以实现工业化的量产，同时尿苷的生产成本低和减少污染少，绿色环保，具有较高的推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种生产尿苷的重组微生物，利用重组微生物生产尿苷以及利用该重组微生物通过生物方法生产尿苷。

背景技术

尿苷，又名尿嘧啶核苷，属于核苷的一种为白色针状结晶或粉末，无气味，味稍甜而微辛。能溶于水，微溶于稀醇，不溶于无水醇。

分子式C₉H₁₂N₂O₆,相对分子质量224.2，熔点163-167℃，比旋8.4°。它主要用于用于巨型红血球贫血，也可与其他核苷、碱基合用于治疗肝、脑血管及心血管等疾病，也是制造氟尿嘧啶(S-FC)、脱氧核苷、碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)等药物的主要原料。

目前尿苷的发酵生产主要集中在日本，但其供应的产品数量较少，且售价偏高。国内仅上海太平洋生物高科技公司一家曾采用RNA水解法生产尿苷，由于工艺落后，成本高，现已停产。尿苷生产主要有化学法和生物法两种。

传统的嘧啶核苷的生产方法是使用核糖核酸(RNA)经化学方法水解，然后制备两种嘧啶核苷，这不仅需要大量的优质RNA原料，而且两种嘌呤核苷(腺苷和鸟苷)及两种嘧啶核苷(胞苷和尿苷)都必须平衡产销，否则成本价会很高。浙江先锋化工科技有限公司利用尿嘧啶和D-核糖在磷钨酸催化下进行缩合反应获得(CN101717420A)。反应成本高，且使用的有机溶剂存在环境污染。

而发酵法则是借助于微生物，通过诱变扩大其合成核苷的能力，从而能够大规模地单一地根据市场需求生产尿苷，降低此类药物的生产成本。20世纪80年代至90年代中期，日本科学家开始发表发酵法生产尿苷的成果，武田药品株式会社利用诱变筛选获得的杆菌发酵生产尿苷，但产量较低5g/L，且存在发酵不稳定等问题(CN85107905)。国内的研究尚未见放大生产的报道。

因此，需要开发一种能替代化学合成、降低污染的尿苷合成方法。人类已经利用微生物来发酵生产核苷类的产品，如beta-胸苷、鸟苷、肌苷和腺苷。而尿苷和上述核苷一样，作为补救合成途径中的一种嘧啶核苷酸中间体，在生物中普遍存在着尿苷的代谢途径，但它很少积累在细胞中或细胞生物的基质中。改造生物，特别是微生物，使其增强尿苷的合成并积累在其生长的基质中，就可以有效地实现尿苷大规模工业化生产，从而降低尿苷的生产成本和减少污染。

预计国内市场年需求量约30吨，国际市场150吨，而世界目前年产量还不足50吨，所以发酵法生产尿苷市场前景看好，出口创汇可观。

发明内容

发明目的：设计和生产具有高产量尿苷生产合成和积累能力的重组微生物，并利用该重组微生物实现尿苷的高产量生物法生产。

技术方案：

1.去除利用和降解尿苷的酶的编码基因使尿苷不再参与细胞中的代谢