[发明专利]一种单链环状DNA的制备方法

说明书

本发明属于核酸技术领域，涉及一种单链环状DNA的制备方法，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，然后将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA按照一定比例混合，加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，制得只有一条链环化的双链产物；从中纯化分离出已环化的单链环状DNA，并进行电泳检测。该方法不需要制备单链DNA，直接以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接反应高效制备中等长度单环DNA；酶法连接成环能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度单链环状DNA的产率。

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种单链环状DNA的制备方法。

背景技术

单链环状DNA，是一种由单链DNA首尾相接形成的环状结构，具有稳定性和灵活性较强、无游离的末端、且不易被常见的核酸酶降解等特性，单链环状DNA逐渐成为构建DNA折纸和分子机器等高级纳米结构的重要元件。此外，单链环状DNA也可以应用于食品、生物、医药等领域；在分子生物学领域，单链环状DNA可用作滚环扩增、转录的模板；在检测领域，可将环状分子机器上设计上G-四聚体及DNAzyme，进行样品中离子等物质的检测；单链环状DNA有着重要的应用价值。

目前，对单链环状DNA的研究多集中在小于100nt的小型单链环和数千nt的天然噬菌体分离出来的大型单链环的应用上。其中，Sleiman等人利用小单环DNA作为自组装基本元件制备纳米材料(Nucleic Acids Research,2017,45(9):e74-e75)；Rothemund等利用M13mp18噬菌体DNA(天然存在的大型单链环状DNA，长度为6407nt)作为脚手架制备各种纳米材料。相较于小型单环DNA与大型单环DNA，中等长度单链环状DNA，即长度为100～1000nt的单链环状DNA具有柔韧性好、携带信息量大、易于观察等优点，且序列信息及长度可根据实验需要进行编辑，因此，中等长度单链环状DNA的制备对DNA纳米技术以及其他相关研究的发展具有重要意义。

当前，常用的成环方法为恒温单链连接，但是恒温单链连接法制备中等长度单环DNA难度较大。首先，游离的中等长度单链DNA本身难以制备；其次，由于单链具有复杂的二级结构，在恒温连接过程中很难打开，甚至会存在单链两端自身配对的情况，导致与成环链两端互补的辅助模板DNA，即splint很难找到单链DNA模板的两端；第三，长于100nt的单链制备困难，成本高，而一般DNA扩增的产物是双链(如PCR技术等)。这些因素很大程度上增加了制备单环DNA的难度。因此，如果能提高中等长度单链环状DNA的产率并得到几乎无副产物的环状DNA或RNA，使其研究和应用大大简化，不但有助于对其拓扑结构的详细研究，也可为环状DNA纳米技术和医疗诊断等研究提供大量的研究材料。

发明内容

本发明针对传统中等长度单环DNA制备过程中，作为重要原料的中等长度单链DNA难以制备、且恒温连接难以打开单链复杂二级结构而导致连接效率较低的问题，提出了一种单链环状DNA的制备方法，以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接反应高效制备中等长度单环DNA。该方法不需要制备中等长度单链DNA，并且在酶法连接成环过程中，能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度单环DNA的产率。

本发明的技术方案是：

一种单链环状DNA的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，并采用单链核酸外切酶切除PCR反应物；

步骤一中双链DNA的制备方法为使用只有其中一条引物的5′端带有磷酸基团的一对引物进行PCR，PCR双链产物中只有以这条带有磷酸基团的引物生成的DNA链的末端带有磷酸基团；