[发明专利]一种脂肪干细胞的纯化方法

权利要求书

1.一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.制备单细胞悬液：在无菌条件下取小鼠腹股沟区脂肪组织，将脂肪组织剪碎至1～3mm³小组织块，剔除组织块中的血管、椭圆型结节和表面粘附的其他组织，放入含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，加入消化液对组织块进行消化制成单细胞悬液；

S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入分散剂，搅拌均匀，然后将单细胞悬液离心，利用直径为105μm的吸附柱网格第一次过滤细胞悬液，再用直径为75μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为40μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞；

S3.培养原代脂肪干细胞：步骤S2得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，期间进行细胞换液，待细胞长至80％时传代，获得原代脂肪干细胞；

S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加红外光照射，然后加入胰酶消化，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代；所述红外光采用波长为700～1000nm的红外光，照射10～30s；

所述步骤S2中的分散剂由聚己内酯和氨基纤维素按质量比为1:(1～1.5)组成；

所述步骤S2中吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在6h～7h。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中的青霉素的浓度为350IU/ml；所述链霉素的浓度为380μg/ml。

3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述步骤S3中得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液反复冲洗2～3次，加入新鲜的完全培养基继续培养，培养36h后弃去完全培养基进行第二次洗涤，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3～5次，加入新鲜的完全培养基继续培养。

4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述完全培养基的组成成分包括：胎牛血清20％，青霉素150IU/ml，链霉素120μg/ml，L-谷氨酰胺1.5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足至100％。

5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中的消化液中含0.075wt.％I型胶原酶、0.5wt.％II型胶原酶和0.1wt.％胰蛋白酶。