[发明专利]一种抗寒性同源八倍体贡菊的栽培和鉴定方法

权利要求书

1.一种抗寒性同源八倍体贡菊的栽培和鉴定方法，其特征在于,包括抗寒性同源八倍体贡菊的栽培和鉴定方法，所述抗寒性同源八倍体贡菊的栽培方法包括以下步骤：

(1)首先通过对贡菊形态学进行分析和染色体倍性进行鉴定，选取优良的四倍体贡菊品种作为诱变材料，贡菊染色体基数为X＝9，体细胞四倍体染色体数目为4n＝2X＝36；

(2)将多个贡菊四倍体组培苗无菌条件下切成茎段，大约120个，将茎段进入到200mg/L的秋水仙素中，200r/min振荡36h，用无菌水冲洗4次；

(3)放置在MS培养基上，温度为25±2℃，光照1600Lux，14h/天；

(4)培养至幼苗生成五片真叶时，取其幼叶进行染色体分析和倍性鉴定，筛选出八倍体植株，按照贡菊常规的栽培方法进行种植；

所述抗寒性同源八倍体贡菊的鉴定方法包括形态学鉴定、生理生化鉴定和分子学鉴定三种方法，所述形态学鉴定方法包括叶表皮绒毛、细胞和气孔的鉴定和低温胁迫下植株表型的鉴定；所述生理生化鉴定方法包括半致死温度的测定和抗氧化酶活性测定，所述半致死温度的测定包括以下步骤：

(a)将四倍体和八倍体贡菊叶片暴露在4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃下1h，每个处理包括6片叶片和3个生物重复；

(b)用电导率仪测量相对电导率REC，并用以下公式计算：相对电导率REC＝(沸腾前EC/沸腾后EC)×100％；

(c)将REC拟合为以下logistic方程：y＝K/(1+ae-bx)，其中，y表示REC；x表示处理温度；a、b和K为参数；

(d)LT50的计算公式如下：LT50＝ln(1/a)/b；

所述抗氧化酶活性测定方法如下：

A、将低温胁迫处理后的植株，采集其叶片，样品用液氮快速冷冻并储存在-80℃的条件下；

B、提取酶粗液，氮蓝四唑法测定超氧化歧化酶(SOD)活性，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶(CAT)活性，比色法测定过氧化物酶(POD)活性，磺基水杨酸法测定脯氨酸含量。

2.根据权利要求1所述的一种抗寒性同源八倍体贡菊的栽培和鉴定方法，其特征在于：所述分子学鉴定方法包括：

(1)筛选与耐寒性相关的基因，包括ICE-CBF-COR抗寒途径中重要的ICE、CBF和COR基因，与活性氧(ROS)相关的基因GSH、SOD、APX和CAT，与脂肪酸合成相关的基因FAD和WRI，与蔗糖合成相关的SPS和BAM，与脯氨酸合成降解相关的基因P5CS、OAT和PDH；

(2)从四倍体和八倍体植物的叶片中提取总RNA。用逆转录酶FastQuant-RT试剂盒(TIANGEN)从1000ng总RNA中合成cDNA；

(3)根据菊花转录组数据，分别找到上述基因序列，分别设计特异性引物，采用荧光定量PCR仪(Agilent 3005)进行定量分析，反应程序如下：25℃2min；4℃15s；-4℃15s；30个循环；

(4)最后加入溶解曲线程序，以EF1α基因为内参，每个样品重复三次，采用2-ΔΔCT公式计算基因相对表达量。

3.根据权利要求1所述的一种抗寒性同源八倍体贡菊的栽培和鉴定方法，其特征在于：所述叶表皮绒毛、细胞和气孔的鉴定方法包括：

(1)待贡菊八倍体植株和四倍体植株长到5周龄时采集叶片，将透明指甲油均匀涂抹于叶片表面，有效去除表皮；

(2)指甲油干燥后，用锋利的镊子将附着在表皮上的指甲油剥下，在显微镜下观察绒毛密度，细胞数量和气孔大小，并ImageJ NIH进行处理。

4.根据权利要求1所述的一种抗寒性同源八倍体贡菊的栽培和鉴定方法，其特征在于：所述低温胁迫下植株表型的鉴定包括以下鉴定方法：

(1)将大小相同的八倍体和四倍体植株移入装有泥炭和珍珠岩1:1混合物的花盆中，置于25℃的室内，光周期为14h光/10h暗；

(2)30天后，在培养箱中用冷处理法处理25cm高的四倍体和八倍体幼苗，三组幼苗分别进行以下处理，4℃处理2小时；

(3)-4℃处理2小时；

(4)正常条件(25℃)设为对照组，每个处理包括3个八倍体植株和3个四倍体植株。