[发明专利]一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明公开的直扩型热启动DNA聚合酶是野生型Taq DNA聚合酶经缺失、定点突变、融合非特异性双链DNA结合蛋白结构域生物突变，并用化学修饰改造而成。本发明直扩型热启动DNA聚合酶可大幅提高DNA聚合酶稳定性，可耐受高浓度的荧光染料和各种抑制剂，可应用于各种来源、组成复杂样本的直接PCR或qPCR检测，使得PCR相关反应和检测更加便利。本发明还公开了一种qPCR反应试剂盒，检测特异性高、荧光信号强，适用于低含量粗提取核酸的快速定量检测，可应用于食品掺杂、微生物检测、转基因植物筛查。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技术是在聚合酶链式反应(PCR)的基础上发展起来的，弥补了普通PCR不可以实时监测及定量的缺陷，成为了当今基因研究的重要工具。SYBR GreenΙ染料法qPCR技术以其成本低、重复性好、适用性强等优点广泛应用于医学研究、病原微生物检测和食品安全检测等诸多领域。

灵敏、精准一直是检测领域发展的需求及目标，SYBR GreenΙ染料法qPCR技术在应用于核酸检测的过程中，Taq DNA聚合酶的活性会受到样品或者样品提取过程中残留的qPCR抑制剂的干扰。如植物核酸样本中的多糖、血液核酸样本中的免疫球蛋白、土壤核酸样本中的腐殖酸等都会抑制Taq DNA聚合酶活性，从而影响qPCR检测的特异性、荧光信号及灵敏度，造成结果的不可靠和不准确。

Taq DNA聚合酶作为qPCR反应的核心组分，具有超强的耐热性和聚合酶活性，其性能直接决定了qPCR检测的速度、特异性及结果的可靠性。热启动DNA聚合酶可在PCR反应前封闭DNA聚合酶的活性，使得PCR反应开始时才释放其活性，可大幅度减少非特异性扩增及引物二聚的形成，是目前qPCR试剂的主要成分。近年来，涌现了多种耐抑制剂的、可以直接对粗样样品进行PCR扩增的Taq DNA聚合酶。但当前的直扩Taq DNA聚合酶可耐受的粗样样品量少，当样本中检测目标含量低时，容易导致假阴性结果(如病毒或细菌感染初期时的样本检测)，且仅适用于普通PCR。用于粗样直接qPCR检测的Taq DNA聚合酶需要更强的耐抑制剂能力，以便在高浓度抑制剂和高浓度染料存在下，保证qPCR检测的特异性及结果的可靠性。因此，亟需研究开发一种用于qPCR的高性能热启动DNA聚合酶。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种直扩型热启动DNA聚合酶。

本发明的另一目的在于提供上述直扩型热启动DNA聚合酶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述直扩型热启动DNA聚合酶的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种直扩型热启动DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的直扩型热启动DNA聚合酶与NCBI登录号为P19821.1的野生型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列相比，具有以下特点：1～289位氨基酸缺失，626位谷氨酸突变为精氨酸，707位异亮氨酸突变为亮氨酸，708位谷氨酸突变为精氨酸，且N末端融合了双链DNA结合蛋白。

所述的双链结合蛋白优选为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的Sso7d。双链结合蛋白可以显著提高DNA聚合酶对模板DNA的亲和力。

编码上述直扩型热启动DNA聚合酶的DNA分子。

所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该序列是根据大肠杆菌表达系统特点进行密码子优化而得，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

一种重组表达载体，是将编码上述直扩型热启动DNA聚合酶的DNA分子克隆入表达载体得到。