[发明专利]一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法

权利要求书

1.一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)组织解离

对采集的蒙古马睾丸组织样本进行消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中反复进行重力沉淀，吸去上清，使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；

(2)组织消化

对解离的生精小管使用胶原酶IV消化20～30分钟；离心去上清后，使用透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶I消化15～20分钟；离心去上清后，使用胰蛋白酶-EDTA和脱氧核糖核酸酶I消化5～10分钟；终止消化，重悬、细胞筛过滤，得到蒙古马睾丸单细胞悬液；

(3)细胞纯化

将蒙古马睾丸单细胞悬液接种于明胶包被的培养皿中，培养6～8小时；收集未贴附于明胶的细胞液，离心去上清后，接种于大鼠尾胶原I包被的培养皿中，培养4～5小时；收集未贴附于大鼠尾胶原I的细胞液，离心去上清后，接种于层粘连蛋白包被的培养板中，培养40～50分钟；收集贴附于层粘连蛋白上的细胞，即为纯化后的蒙古马睾丸精原干细胞；

(4)细胞培养

将纯化后的蒙古马睾丸精原干细胞接种于蒙古马睾丸支持细胞饲养层进行体外培养。

2.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述组织解离的步骤在4℃环境中的冰上进行。

3.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述组织解离的步骤中，进行重力沉淀的方法为：将所述离心管摇晃后置于冰上5～10分钟，弃上清；所述重力沉淀反复进行3～5次。

4.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，对解离的生精小管使用胶原酶IV消化的过程中，也加入脱氧核糖核酸酶I。

5.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述组织消化的步骤在37℃水浴锅中进行。

6.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述组织消化的步骤中，使用含有15％胎牛血清的培养液终止消化；使用DMEM/F12培养液进行重悬。

7.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述细胞纯化的步骤中，在将蒙古马睾丸单细胞悬液接种于明胶包被的培养皿中之前，对蒙古马睾丸单细胞悬液进行解聚，所述解聚的方法为：使用20ml注射器的18G针头进行15～25次反复吸取。

8.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述细胞纯化和细胞培养的步骤在37℃下于5％CO₂的培养箱中进行。

9.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述蒙古马睾丸支持细胞饲养层为提取蒙古马睾丸支持细胞后，对蒙古马睾丸支持细胞进行传代、灭活、冻存和复苏得到。

10.根据权利要求9所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述对蒙古马睾丸支持细胞复苏的方法为：将冻存的蒙古马睾丸支持细胞解冻后，加入明胶包被的培养板中，在37℃下于5％CO₂的培养箱中进行培养。