[发明专利]表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建及其应用方法

权利要求书

1.表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于该构建方法包括如下步骤：

步骤1）将目的基因直接人工合成到pCA13质粒载体上得到pCA13-gene，用BglII单酶切从pCA13上切下携带目的基因的表达框；所述目的基因为合成基因IL-33；

步骤2）将携带目的基因的表达框直接连接到同样BglII单酶切的pSD55质粒上，获得pSD55-gene；

步骤3）：将pSD55-gene质粒用PmeI线性化，将线性化的pSD55-gene质粒转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生含有目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

步骤4）将MluⅠ鉴定正确的重组质粒用PacⅠ酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒ZD55-gene；

所述pCA13属于常规载体，所述pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒IE启动子（-299-+72）及SV40 poly A加尾信号； pSD55是pShuttle质粒通过PCR形式添加Ad5 E1区且删除了E1B55区构建而成的，所述pShuttle质粒为常规穿梭质粒载体。

2.根据权利要求1所述的表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于该构建方法包括如下步骤：

步骤1）：人工合成鼠IL-33至pCA13载体的多克隆位点，获得pCA13- Kozak-CD8-IL-33-HA质粒，其中，在合成鼠IL-33时，在IL33表达框5’端加入Kozak与人CD8α信号序列，并在表达框的末端加入HA标签，获得综合序列，通过将综合序列直接合成至pCA13多克隆位点的HindIII与XbaI间，获得pCA13- Kozak-CD8-IL-33-HA质粒；

用BglII单酶切pCA13- Kozak-CD8-IL-33-HA质粒，获得完整表达框；

步骤2）：将表达框连接到同样经BglII单酶切腺病毒穿梭质粒载体pShuttle-Surp-E1A-△E1B55kD上，得到含有目的基因的pSD55-IL-33质粒；

步骤3）：将质粒pSD55-IL-33用PmeI线性化，将线性化的质粒pSD55-IL-33转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生含有目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

步骤4）：重组质粒MluⅠ单酶切鉴定有五条带为鉴定正确标准，将MluⅠ鉴定正确的重组质粒用Pac I酶切线性化、去磷酸化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到重组溶瘤腺病毒。