[发明专利]微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法

权利要求书

1.微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、菌株预处理，步骤S2、菌株诱变，步骤S3、种子罐培育，步骤S4、发酵罐培育，步骤S5、放罐，步骤S6、酶提取；

S1：将产黄青霉菌株斜面上的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡30～40min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球计数板进行计数，稀释成100个/ml的孢子悬液；

S2：首先进行磷酸二丁酯诱变：取5ml孢子悬液加入到体积为25ml的三角瓶中，再加入0.2ml的硫酸二丁酯(体积浓度50％)，振荡不同时间，再加入0.5ml的硫代硫酸钠(85％)终止反应，稀释梯度为10-1～10-6，取各剂量的(10-4～10-6)3个梯度的孢子悬液0.2ml，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养1～2d，计算菌落数，绘制致死率曲线，挑取筛选平板上蓝色圈较大的单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生；

其次进行低温诱变：取5ml的孢子悬液，加入到体积为25ml的三角瓶中，再瓶内不断加入冰块，经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃至25℃至20℃至15℃至10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活，选取酶活高的菌株进行保存；培养完成后，筛选出具有活化性高低温活性好的菌株；

S3：罐压0.1-0.12MPa，培养温度25-20℃，通风量32-35m³/h，搅拌转速60-120r/min，pH控制6.0-6.5；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养；

S4：罐压0.1-0.12Mpa，培养温度20-15℃，搅拌转速240-270r/min，pH控制5.0-6.0；通风量：0-20h为32-35m³/h，20-22h为38-40m³/h，22h-放罐为25-30m³/h；当pH升至6.0时，开始补料，控制pH在5.0-6.0；

S5：发酵罐培养至48-78h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；

S6：将发酵液在4000～8000rpm离心收集液体，收集到的上清液即为粗酶液，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述步骤S2中进行磷酸二丁酯诱变时采用的平板培养基(葡萄糖12％、NaNO₃1％、K₂HPO₄1.5％、KCl0.1％、MgSO₄0.1％、琼脂3％-4％；)。

3.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述步骤S2中进行低温诱变的液体培养基(葡萄糖12％、CaCO₃1-5％、KI0.5％、磷酸二丁酯0.5mol/L、琼脂3-4％，pH6.0)。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述步骤S3中种子罐培养基(葡萄糖25％，蛋白胨20％，CaCO35％，KI1％，MgSO40.8％，pH6.5)。

5.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述步骤S3中培养温度优选采用20℃，通风量35m³/h，搅拌转速90r/min。

6.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述步骤S4发酵罐培养基(蔗糖24％、蛋白胨1％、CaCO₃1％、K₂HPO₄0.5％、KCl0.5％、MgSO₄0.2％、NaNO₃2％，pH6.5)。

7.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述步骤S4中培养温度优选采用15℃，搅拌转速240r/min。