[发明专利]一种三叶青内生真菌、其筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种三叶青内生真菌、其筛选方法及其应用，具体涉及微生物技术领域，该三叶青内生真菌命名为TH01，保藏在中国微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号为:CGMCC No.17664。该三叶青内生真菌的筛选方法为：选取健康的三叶青叶片，并对去进行表面消毒，消毒后的三叶青叶片剪去边缘黄化部分，避开叶脉，剪取3cm²左右叶片。将剪好的叶片放入PDA培养基，置于25℃生化培养箱中培养7‑9天；培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到TH01内生真菌；对得到的TH01内生真菌进行ITS测序鉴定。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体为一种三叶青内生真菌、其筛选方法及其应用。

背景技术

三叶青，又名金线吊葫芦，是我国特有的珍稀名贵药材，在我国长江以南广大地区均有分布，2018年被浙江省列入新“浙八味”重点培育品种。具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效，常用小儿高热惊厥、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性脑膜炎、毒蛇咬伤、扁桃体炎、跌打损伤等疾病的治疗，被民间称为“植物抗生素”，具有非常高药用和经济价值。

微生物发酵是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵，产生的代谢废物绿色环保，不会对环境造成污染，使用到的仪器设备操作简单、安全，容易实施，因此具有高效专一、条件温和、经济快捷、污染低和可循环率高等特点，广泛被应用于活性次生代谢产物的制备和转化。大量研究表明，内生真菌可产生多种结构新颖、活性显著的真菌次生代谢产物，包括内酯类、聚酮类、生物碱、萜类、酚酸等，且大多具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节、促进骨髓增殖、抑菌、杀虫等，是重要的微生物药源分子宝库。但是，关于一种能够通过微生物发酵产生三叶青活性成分对羟基苯甲酸、新绿原酸、异鼠李素、二咖啡酰奎宁酸的内生真菌及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种三叶青内生真菌、其筛选方法及其应用，该三叶青内生真菌可经发酵得到多种具有抗氧化活性、抑菌以及抗肿瘤化合物的优点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种三叶青内生真菌，所述三叶青内生真菌命名为Penicillium PimiteouienseTH01，保藏在中国微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号为:CGMCC No.17664。

作为优选，一种三叶青内生真菌，所述三叶青内生真菌的序列如SEQ.NO 1所示。

本发明还提供一种三叶青内生真菌的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：

S01、对三叶青叶进行表面消毒，消毒后的三叶青叶片剪去边缘黄化部分，避开叶脉，剪取3cm^２左右叶片；

S02、将剪好的叶片放入PDA培养基，置于25℃生化培养箱中培养7-9天；

S03、将S02培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到TH01内生真菌；

S04、对步骤S03得到的TH01内生真菌进行ITS测序鉴定。

本发明还提供了上述三叶青内生真菌在发酵制备得到对羟基苯甲酸、新绿原酸、异鼠李素、二咖啡酰奎宁酸的应用。

更加具体地，上述应用具体步骤包括：

（1）取三叶青内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，26~30℃活化培养约3d，得到活化完成的菌种；

（2）将活化后的菌种用真菌打孔器打成5mm×5mm的菌饼，无菌条件下转接至已灭菌的液体PDB发酵培养基中，26~30℃下120rpm培养7d，得到菌丝发酵液；