[发明专利]一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。该检测试剂盒包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条；所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3‑spacer进行末端封闭。本发明使用RPA‑LFS(The isothermal recombinase polymerase amplification and the lateral flow strip)方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。

背景技术

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)，属于鲑科(Salmonidae)、大马哈鱼属(Oncorhynchus)，自19世纪起在美国开始淡水养殖，我国曾从朝鲜、美国、日本等国多次引种，目前在20多个省市区都有人工养殖，是国内养殖范围较广的冷水鱼类。生食淡水养殖的虹鳟鱼掺假的三文鱼，相比海水养殖的三文鱼，极易带来寄生虫感染的风险。因此，迫切需要建立快速准确的检测手段，用于鉴定三文鱼中掺假的虹鳟。

随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)为基础的DNA分析成为目前物种鉴定方法的主流。例如，DNA条形码技术和荧光定量PCR等。但DNA条形码技术需要对PCR扩增产物进行测序，成本高且耗时较长；荧光定量 PCR对设备和操作水平的要求较高；近年由于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA技术)、侧流层析试纸条检测技术(LFS)的兴起，本发明通过RPA-LFS技术快速鉴定虹鳟鱼，以期为三文鱼中是否有虹鳟鱼掺假检测带来新的技术参考。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为om-F、om-R，且序列分别为

ATGCATGCAATCCGTAGCTACCCTCTCCCCTCCAC、 Biotin-AAGCTAATATTTTCTGTGCCAAGCAGTCAGTGGGT，其探针为om-P，

且序列为

FITC-ACTAGGATTTATGGCTGAACGTTTCTATAG[THF]GTTTTGCTGAGTAGAC-/C 3-spacer/。

一种虹鳟鱼特异性的检测试剂盒，其包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条，所述反向引物5'端用生物素进行标记，所述探针5' 端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，且距5'端30bp、距3'端16bp的C碱基处使用[THF]进行替换，所述3'端用C3-spacer 进行末端封闭，所述正反向引物长度为35bp，所述探针长度46bp，所述检测试剂盒包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂。

优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。

本发明的有益效果：

本发明使用RPA结合胶体金试纸条快速检测虹鳟鱼，能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高，耗时短。

附图说明

图1为虹鳟鱼和大西洋鲑鱼mb基因序列不保守区比对结果；

图2为本发明实施例中RPA扩增产物的侧流层析试纸条检测结果；