[发明专利]一种创伤弧菌RPA-LFS快速检测方法的建立及应用

说明书

本发明公开了一种创伤弧菌RPA‑LFS快速检测方法的建立及应用，包括引物设计及筛选、探针设计及筛选、RPA‑LFS特异性检测、RPA‑LFS反应温度优化、RPA‑LFS反应时间优化、RPA‑LFS最低检出限测定，引物探针筛选探针长度至少46bp，所述探针5’末端用FITC进行标记，3’末端引入3C‑spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点，所述AP位点前至少要保留30bp的碱基，AP位点之后至少有15bp的碱基，下游引物的5’末端标记生物素。本发明对检测人员的实验操作要求不高，在进行现场检测时，不需要聘请专业的技术人员，养殖场工作人员就可以进行检测，不需要凝胶成像系统等设备，既降低了检测成本，又缩短了检测实践，并且能够可视化检测。

技术领域

本发明涉及海产品养殖和食品安全领域，尤其涉及一种创伤弧菌RPA-LFS快速检测方法的建立及应用。

背景技术

目前，检测创伤弧菌的常用方法有传统的培养法，免疫诊断，核酸诊断，其中，核酸诊断主要有聚合酶链式反应(PCR)和(LAMP)两种方法，传统培养法是将送检的样品增菌后进行分离培养，随后对分离培养的可疑菌株进行形态学和生化鉴定，对鉴定结果进行综合评价，确定可疑菌株是否是创伤弧菌。该方法检测周期长，工作量大，对工作人员实验技能要求高，该实验操作只能在实验室进行，无法进行现场检测。

传统的培养法检测创伤弧菌的检测周期长，工作量大，对工作人员实验技能要求高，该实验操作只能在实验室进行，无法进行现场检测。PCR要经过三个温度阶段，实验设备要求高且耗时长，因此，PCR技术被局限于实验室研究，不宜做野外实地检测(POCT检测)。LAMP在很大程度上避免了PCR的缺陷，但其自身也存在一定的问题：1、LAMP引物设计比较复杂，需要2-3对引物；2、LAMP很容易产生假阳性的结果，降低结果的精确度；4、LAMP扩增时间一般在40min-60min，在一定程度上增加了时间成本。

免疫诊断是结合抗原抗体免疫反应和酶的高效催化反应的一种可视化检测。通过酶降解底物呈现的颜色深浅来判断检测抗原的多少。该方法特异性强，但对试剂的选择性高，灵敏度低，并且容易出现交叉反应。

核酸诊断技术因其特异性强，灵敏度高而受到人们的高度关注，常用的核酸诊断技术主要包括常规PCR扩增和LAMP两大类。据报道PCR技术用于检测病原体的种类已超过100多种，但是由于要经过三个温度阶段，实验设备要求高且耗时长。因此，PCR技术被局限于实验室研究，不宜做野外实地检测(POCT检测)。与PCR相比，等温扩增技术更简单，快速，其特异性和灵敏度与PCR相当，该技术既克服了传统PCR技术高温变性获得单链模板的缺陷，也避免了升降温的过程，无需温控设备，很大程度上降低了检测成本。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种创伤弧菌RPA-LFS快速检测方法的建立及应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种创伤弧菌RPA-LFS快速检测方法，包括以下步骤：

1)引物设计及筛选：

上游引物：5’-GAGATGGATTCTTTGTATAACATTGCGT

下游引物：5’-ACGATGACGTTGGTTGTGTTACATTATC。

2)探针设计及筛选：

探针：

FITC-GGTGAAGTTGGCTGGTGGTTATTTTCAGAA[THF]CATGGTTGTTGAGCTC-SpC3。

3)RPA-LFS特异性检测。

4)RPA-LFS反应温度优化。

5)RPA-LFS反应时间优化。