[发明专利]携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用，该SIKE基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。重组溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤：(A)将SIKE的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB‑SIKE质粒；(B)pCB‑SIKE质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒。通过实验证实，本发明的溶瘤痘苗病毒oncoVV‑SIKE不仅对肝癌细胞、乳腺癌细胞或胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞的药物体外抑制效果显著，且呈剂量依赖，而且病毒复制水平显著提高，同时对肿瘤动物模型也具有显著的治疗效果。因此本发明可用于制备抗肿瘤的病毒药物，为肿瘤的病毒治疗提供了新的靶点，具备广阔的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种携带IKKε抑制因子(Suppressor ofIKKε, SIKE或SIKE1)基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

背景技术

溶瘤病毒是指能够选择性感染并损伤肿瘤组织的有治疗价值的病毒。溶瘤病毒有着悠久的历史，至今已有分属10个病毒家族的溶瘤病毒进入临床试验，包括腺病毒(Adenovirus)、柯萨奇病毒(Coxackie virus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、细小病毒(Parvovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)与水疱性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus)。目前已有疱疹病毒T-VEC被FDA批准治疗黑色素瘤。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。

痘苗病毒是一种有被膜的双链DNA病毒，相比其他溶瘤病毒有以下几个优点：(1)其在DNA病毒中是独一无二的，因为它只在细胞质中复制，以尽量减少整合在宿主基因组内的风险；(2)痘苗病毒最早被制成疫苗来对抗天花病毒，其安全性有较大的保障； (3)痘苗病毒的克隆能力大，可以允许较大长度的基因片段的插入；(4)痘苗病毒在实验动物和人体上均表现出向癌组织靶向性聚集的能力。因此痘苗病毒已成为癌症治疗的理想病毒载体。

目前常见的溶瘤痘苗病毒大都经过减毒改造，包括胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase， TK)基因缺失或TK/痘苗病毒生长因子基因双缺失的病毒株等。TK基因的缺失使痘苗病毒的复制更依赖于细胞内的TK水平，而癌细胞相比于正常细胞往往具有更高水平的TK；另外，痘苗病毒的复制还依赖于表皮生长因子受体EGFR/Ras通路的驱动，从而使其对癌细胞具有很强的选择性。

IKKε抑制因子(Suppressor of IKKε,SIKE或SIKE1)是一个参与调节IKKε及TBK1信号通路的因子，过表达SIKE可抑制IKKε与TBK1介导的抗水疱性口炎病毒的应答 (Huang,J.,T.Liu,et al.2005.SIKE is an IKK epsilon/TBK1-associated suppressor ofTLR3- and virus-triggered IRF-3 activation pathways.EMBO J 24(23):4018-4028.)。SIKE通过与转录因子IRF3竞争与TBK1的互作，从而抑制TBK1对IRF3的磷酸化和激活(Marion,J. D.,C.F.Roberts,et al.2013.Mechanism of endogenous regulation ofthe type I interferon response by suppressor of IkappaB kinase epsilon(SIKE),a novel substrate of TANK-binding kinase 1(TBK1).J Biol Chem 288(25):18612-18623.)。可见，SIKE某种程度上参与了细胞对某些病毒感染的应答。然而，SIKE是否具有抗肿瘤作用尚未见报道，利用溶瘤痘苗病毒作为载体来外源表达SIKE是否可应用于肿瘤治疗是个有待解决的问题。

发明内容