[发明专利]一种带有筛选标记桉树遗传转化方法

权利要求书

1.一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、获得尾巨桉无菌瓶苗；

S2、无菌苗茎段切成0.5～1cm长的小段，接种在愈伤诱导培养基上，暗培养一周，培养温度25 ± 2℃；

然后转入光照12 h·d^-1，光照强度为2000～500 lx，温度25 ± 2℃条件培养2-3周；

S3、经愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织转入浸染培养基，超声波30s后加入含有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌，避光28℃，200r摇床摇3h；

S4、将浸染后的愈伤组织转入不定芽诱导培养基上，在25±2℃、暗培养1周后，再转到光照强度2000～500 lx条件下培养2～3周；

S5、经不定芽诱导培养基培养上的愈伤组织转入芽增殖培养基上，并切下芽在荧光微镜下观察是否有红色荧光，然后在25±2℃、光照强度2000～2500 lx条件下培养2～3周；

S6、经芽增殖培养基培养的愈伤组织转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500 lx条件下培养，促进芽伸长；

S7、当芽伸长到3～4 cm时，将不定芽转入生根培养基上培养，以促其生根；

S8、将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基为：MS培养基 + LC 1.0mL/mL+ IAA 0.5mg/mL + Vc 1 mg/mL+ 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9 。

3.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，所述浸染培养基为：MS培养基+蔗糖30g/L。

4.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基为：MS培养基 +6-BA 0.5mg/mL + 萘乙酸（NAA）0.5mg/mL+ 腐胺 500 mmol/L+ 亚精胺 100mmol/L +维生素C（ Vc） 1 mg/mL + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9 。

5.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，所述芽增殖培养基为：1/2 MS培养基 + 6-BA 0.5mg/mL +萘乙酸（NAA） 0.5mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9 。

6.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，所述生根培养基为：1/2 MS培养基 + 吲哚丁酸（IBA）1mg/mL + 蔗糖30 g/L + 琼脂7 g/L，pH 5.8～6.0 。

7.根据权利要求5或6所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，其特征在于，所述1/2 MS培养基为：大量元素为MS培养基的一半，其余不变，蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH为5.8～5.9。