[发明专利]一种检测人KRAS基因2号外显子突变的PCR试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人KRAS基因2号外显子突变的PCR试剂盒，试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，其中，核酸扩增试剂包括KRAS G12反应液和KRAS G13反应液，反应液中分别含有用于检测KRAS G12和G13突变的特异性引物和探针，每个反应液中包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针。本试剂盒采用ARMS‑PCR的方法，分别设计了针对G12和G13位点特异性的引物和探针；采用等位基因特异性扩增定量PCR技术，对KRAS基因G12和G13突变进行定性检测，从而辅助结直肠癌、肺癌和胰腺癌临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度；能检测出50ng DNA总量中低至0.1%水平的突变。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种检测人KRAS基因2号外显子突变的PCR试剂盒。

背景技术

KRAS基因是人类最重要的原癌基因之一,位于人染色体12p12.1,由6个外显子组成,编码蛋白约21kDa。KRAS突变主要位于2号外显子的第12、13和3号外显子第61号氨基酸编码子，这些突变会影响RAS介导的GTP水解作用，并会导致KRAS蛋白持续保持活化状态，不再依赖上级信号的刺激，处于与GTP持续结合的状态，导致下游的信号通路异常活跃，从而促进细胞的生长与增殖，细胞增殖失控而癌变。

KRAS是非小细胞肺癌（NSCLC）常见的突变基因之一,突变发生率为15%~30%,2号外显子的第12、13和3号外显子第61号氨基酸编码子突变是主要的KRAS突变类型。NCCN非小细胞肺癌（NSCLC）指南指出，KRAS突变的NSCLC患者与EGFR-TKI原发耐药相关，明确规定使用吉非替尼（易瑞沙）、厄洛替尼（特罗凯）和埃克替尼（凯美纳）对非小细胞肺癌进行治疗前需要检测KRAS突变状态，KRAS野生方可用药。KRAS蛋白是EGFR信号传导通路中的一个关键的下游调节因子,突变型Kras基因不受上游EGFR基因状态的影响，始终处于激活状态,这也是具有突变型Kras基因患者对抗EGFR药物治疗无效的理论基础。另外，2019年ASCO会议报道AMG510药物后线治疗KRASG12C突变的NSCLC患者I期临床数据ORR可达50%。

直肠结肠癌(colorectalcancer,CRC)是常见的恶性肿瘤。研究表明,CRC发生与多种基因突变密切相关,其中包括KRAS、BRAF、MEK、ERK。以上基因均参与细胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等过程的调节。有50%左右的CRC患者表现为KRAS和BRAF基因突变,这些突变病例采用外科治疗存在一定困难,所以倾向于选择基因靶向治疗。一些研究表明KRAS突变与EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗的耐药相关，NCCN结肠癌和直肠癌指南不推荐KRAS2、3、4号外显子突变的结直肠癌患者使用西妥昔单抗和帕尼单抗等治疗。

胰腺癌是消化系统中侵袭性最高的恶性肿瘤，以导管腺癌为主。虽然和其它肿瘤相比，胰腺癌发病率较低，但由于其极低的5年生存率（小于7%），使胰腺癌成为癌症相关死亡因素的第四大主因。长期以来，依据形态学进行病理学诊断一直是胰腺癌诊断的金标准，但由于肿瘤在分子水平上具有高度异质性，传统的病理形态学诊断随着国、内外分子诊断技术的发展逐渐不能满足胰腺癌研究的发展需求。因此，在原有的病理组织学诊断的基础上深入研究胰腺癌的分子分型对胰腺癌的诊断、预后及治疗都有着十分重要的意义。目前大量研究已证实，原癌基因的活化和抑癌基因的失活是肿瘤发生的关键机制。在胰腺癌中，原癌基因Kras，抑癌基因TP53、CDKN2A/p16及SMAD4是目前公认的胰腺癌四大“高频驱动基因（high-frequencydrivergenes）”。随着基因突变的累积，胰腺癌前病变逐渐演变进展为胰腺癌。其中Kras是胰腺癌中突变最早且机率最大的基因，超过90%的患者存在Kras基因突变，是胰腺癌发生发展过程中最重要的驱动基因，因而检测KRAS基因突变状态可以用来区分胰腺病变的进展程度。