[发明专利]一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用

说明书

本发明公开了一种用于发酵合成岩藻糖基化寡糖的大肠杆菌的构建方法，包括步骤：(1)在原核宿主细胞中过表达编码从头合成GDP‑L‑岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(2)在原核宿主细胞中表达编码岩藻糖基转移酶的外源基因；(3)在原核宿主细胞中降低或消除GDP‑甘露糖水解酶活性；(4)在原核宿主细胞中降低或消除β‑半乳糖苷酶活性。本发明通过所述方法构建了一种大肠杆菌，所述大肠杆菌在可用于制备岩藻糖基化寡糖。采用本发明构建的工程菌进行5L罐的岩藻糖基化寡糖(以2'‑岩藻糖基乳糖为例)的发酵生产验证，结果显示2'‑岩藻糖基乳糖(2'‑FL)的生产水平最高可达50g/L。

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，还涉及一株大肠杆菌，尤其是利用所述大肠杆菌合成岩藻糖基化寡糖的方法。

背景技术

目前岩藻糖基化人乳寡糖(2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖等)的生物合成必需三要素：核苷酸活化的岩藻糖GDP-L-岩藻糖(GDP-L-fucose，主要作为该合成反应的供体底物，正常情况下细胞内水平极低，且不易大规模生产，价格昂贵)，受体糖(主要作为该反应中接受岩藻糖的底物，如乳糖、N-乙酰乳糖胺、岩藻糖基乳糖、乳-N-二糖、乳-N-四糖、唾液酸乳糖、二唾液酸乳糖等)，岩藻糖基转移酶(FucT，需要外源引入且高表达该酶，可以来源于幽门螺杆菌Helicobacter pylori、空肠弯曲杆菌Campylobacterjejuni、肝幽门螺杆菌Helicobacter hepaticus、鼬鼠螺杆菌Helicobacter mustelae、普通拟杆菌Bacteroides vulgatus ATCC8482以及大肠杆菌O86、O128、O126、O127等，在该合成反应中它能催化L-岩藻糖分子从GDP-L-岩藻糖转移到受体糖分子上，从而形成岩藻糖基化的人乳寡糖)；

在现有技术方案中，对于供体底物GDP-L-岩藻糖的生物合成目前已经确定有两种途径：从头途径(De novo pathway)和救助途径(Salvage pathway)。

从头合成途径(De novo pathway)主要起源于细菌的中央代谢活动，GDP-L-岩藻糖本身可以参与荚膜异多糖酸的生物合成，作为细胞壁的主要成分。该路径主要以糖酵解中间产物果糖-6-磷酸为起点，依次经过ManA(mannose6-phosphate isomerase，甘露糖-6-磷酸异构酶)，ManB(phosphomannomutase，磷酸甘露糖变位酶)，ManC(α-D-mannose-phosphate guanylyltransferase，α-D-甘露糖-磷酸鸟嘌呤基转移酶)，Gmd(GDP-mannose-4,6-dehydratase，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶)和Fcl(GDP-L-fucosesynthase，GDP-L-岩藻糖合成酶)五个酶促反应步骤，生成中间体GDP-L-岩藻糖。整个反应过程中，1摩尔葡萄糖转化成1摩尔GDP-L-岩藻糖，并消耗1摩尔GTP和NADPH作为辅因子。在此基础上，只要外源引入特定的岩藻糖基转移酶和受体糖底物，理论上就能催化合成所需的岩藻糖基化的人乳寡糖。

补救合成途径(Salvage pathway)最初源于哺乳动物细胞和一些拟杆菌的代谢系统。该途径从L-岩藻糖开始，胞外L-岩藻糖被转移到细胞内，再依次通过L-岩藻糖激酶和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶的催化作用合成GDP-L-岩藻糖。目前已经公开了一种来源于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的双功能酶(Fkp)可以同时含有L-岩藻糖激酶活性和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶活性，这无疑促进了GDP-L-岩藻糖代谢工程化合成的可行性。整个反应过程中，1摩尔L-岩藻糖可以转化成1摩尔GDP-L-岩藻糖，同时消耗1摩尔ATP和GTP作为辅因子。整体上看，补救合成路径要相对简单，但是所需要的底物L-岩藻糖不易获得，且市场价格较高，因此该路径目前还不适合规模化的岩藻糖基化寡糖的生产。