[发明专利]一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法

说明书

本发明提供了一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法，属于疫苗技术领域。壳聚糖修饰的纳米酶可通过酶催化方式激活树突状细胞ROS水平进而增强天然免疫水平，具有显著的黏膜免疫佐剂特性，而且还能增加流感病毒黏附黏膜的数量和延长黏附时间。将壳聚糖修饰的纳米酶交联灭活流感病毒滴鼻免疫后，显著增强针对流感病毒特异性黏膜免疫和全身系统性免疫水平，具有显著的抗原靶向黏膜递送能力和黏膜佐剂特性，所制备的黏膜疫苗，通过两次滴鼻免疫后可完全保护小鼠对流感病毒的致死性攻击，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法。

背景技术

流行性感冒简称流感(Influenza)，是由流感病毒(Influenza virus)引起的一种人畜共患传染病。流感病毒可分为A型、B型和C型流感病毒，其中A型流感病毒对人类的威胁最大[1]。该病毒主要通过呼吸道传播，历史上流感病毒的大流行给全世界各国人民造成了人员和经济上的巨大损失。1917年-1919年欧洲暴发的西班牙流感(病毒亚型H1N1)疫情，造成5000万人死亡，是历史上最严重的流感疫情[2]。目前预防和控制流感病毒最常用的方法是肌肉注射流感病毒灭活疫苗，包括全病毒灭活流感疫苗和裂解灭活流感疫苗。但是肌肉注射接种疫苗不能在黏膜部位诱导特异性SIgA抗体，并且容易在接种部位产生炎症和形成肉芽肿。鼻腔是流感病毒进入机体的主要入口，如果在鼻腔和上呼吸道建立有效的黏膜免疫保护，将有效阻止流感病毒的入侵，将病毒阻滞在早期阶段，该黏膜免疫策略也可提高交叉保护水平，特别是针对流感病毒多亚型多分支的现状，黏膜免疫可依据“共同黏膜免疫系统”的理论，在消化道和生殖道等其它黏膜面建立黏膜免疫保护，可有效阻断流感病毒从其它途径入侵和散播。全病毒灭活流感疫苗虽然具有较高的安全性[3]，但是它不能在鼻腔黏膜上皮细胞中繁殖，所以单独应用灭活流感疫苗通过鼻腔免疫不能诱导有效的免疫应答。因此亟需开发具有抗原递送能力高和免疫刺激能力强等多重功能的黏膜免疫佐剂。

鼻腔黏膜免疫可以阻断流感病毒的入侵，但是由于灭活H1N1流感病毒和鼻腔黏膜均带负电荷，所以滴鼻免疫灭活H1N1流感病毒后，病毒粒子在鼻腔黏膜处停留时间很短，加之灭活的H1N1流感病毒不能在鼻腔黏膜上皮细胞中增殖，严重限制了抗原递送量，导致单独应用灭活H1N1流感病毒进行鼻腔免疫频频失败。尽管现有研究选用了霍乱毒素(CT)作为黏膜佐剂，但安全性问题始终无法解决。也有人选用Toll-like激动剂如CpG等，但该类佐剂成本较高，而且功能往往单一，难以同时解决黏膜疫苗诸多问题，较难实现应用。

Fe₃O₄纳米酶(Iron oxide nanozyme，IONzyme)是新近开发的纳米制剂，被广泛应用于蛋白质与核酸的分离纯化、细胞标记、肿瘤治疗以及核磁共振成像[4-6]。Fe₃O₄纳米酶可模拟多种类酶活性，如过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性等[7]。研究发现，纳米酶具有调节活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的能力[8]，IONzyme在酸性条件下，具有类过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，有利于胞内ROS的产生。而ROS的活化有助于树突状细胞(Dendritic cells，DCs)成熟[9]，提高天然免疫水平[10]。但IONzyme在黏膜佐剂的应用中还没有相关报道。

参考文献：

[1]甘孟侯.禽流感:第二版[M].中国农业出版社,2002.

[2]孙波.流行性感冒危害及接种流行性感冒疫苗的研究.预防医学与公共卫生[J].2016,13(4):76-78.

[3]吴俊东,朱凤才.流感疫苗研究的进展.江苏预防医学[J].2008,19(2):83-85.