[发明专利]基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒

权利要求书

1.基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；

所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；

所述建库试剂包括末端修复加A 试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂和扩增试剂；

所述RNA探针为识别相关MSI位点的RNA单链探针，所述RNA探针的片段长度在90-120nt之间，且修饰有生物素，所述RNA探针与DNA文库片段进行杂交，捕获链霉亲和素特异性的识别生物素、特异性的洗脱和富集程序，得到最终所需的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒的使用方法，具体步骤为：

S1：利用超声波进行物理打断DNA；

S2：进行末端修复和加A654尾反应，取用S1中的反应液50ul与末端修复加A尾反应液15ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀30分钟后加热到65℃反应30分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液A；

S3：进行加接头反应，取用S2中的65ul反应液A、加接头缓冲液25ul、加接头酶5ul和接头5ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀15分钟后加热到70℃反应10分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液B；

S4：进行第一步纯化反应，获得反应液C；

S5：进行文库扩增反应；取用S4中的15ul反应液C、扩增混合液25ul和通用引物10ul进行轻微吹打混匀，获得反应液D；

S6：进行第二步纯化反应，获得反应液E；

S7：进行杂交反应，获得反应液F；

S8：进行捕获反应，获得反应液G；

S9：进行PCR富集反应，获得反应液H；

S10：进行第三步纯化反应，获得反应液J；

S11：质控品数据分析。

3.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S1利用超声波进行物理打断DNA具体操作为：检测开始前30分钟启动Covaris M220仪器，检查Covaris槽装满AFA-grade water（新鲜去离子水）至刚好淹过槽口，且覆盖管的玻璃部分，设置温度在4℃之间，以保证读到的水浴温度为4℃；根据microTUBE类型（50 μL 和130 μL）和目标片段（200~300 bp），预先设置打断程序；将250 ng的高质量白细胞gDNA 加到microTUBE管，使用无核酶水稀释至总体积为55 μL，盖上管盖使用预设程序进行基因组打断。

4.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液C的具体步骤为：

S41:纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀;

S42:取80 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:0.8）加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min;

S43:配置新鲜的75%乙醇;

S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；

S45:加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；

S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；

S47:加水18 ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。