[发明专利]一种基于全基因组重测序的甘蓝型油菜蜡粉基因定位方法

权利要求书

1.一种基于全基因组重测序的甘蓝型油菜蜡粉基因定位方法，包括以下步骤：

1)以甘蓝型油菜纯合两型系D0721的不育株为母体，临保系D1577为父本，进行杂交，得到F1代全不育系；

2)将F1代全不育系和无蜡粉性状的恢复系D0936进行杂交，得到F2代；

3)在F2～F6代的15：1分离群体中选择有蜡粉性状的植株自交；

4)在所述F6代的3：1分离群体中选择无蜡粉性状的植株作为第一子代备选植株，在所述F6代的全部有蜡粉表型不分离群体作为第二子代备选植株，将D0721作为第一亲本备选植株，D1577作为第二亲本备选植株，D0936作为第三亲本备选植株，得到五组备选植株；

5)分别提取所述五组备选植株的基因组DNA，利用提取到的基因组DNA分别构建文库，对各个文库进行30×覆盖度的全基因组重测序，得到五组测序数据，分别为第一子代测序数据、第二子代测序数据、第一亲本测序数据、第二亲本测序数据和第三亲本测序数据；

6)利用Trimmomatic对所述五组测序数据分别进行质量控制，选择Pherd分值大于Q20的序列样本，得到五组待分析数据，分别为第一子代待分析数据、第二子代待分析数据、第一亲本待分析数据、第二亲本待分析数据和第三亲本待分析数据；

7)将所述五组待分析数据分别与甘蓝型油菜参考基因进行比对，去除PCR重复，注释SNP和InDel，完成基因分型；

8)基于所述基因分型的结果，以第一亲本待分析数据、第二亲本待分析数据和第三亲本待分析数据作为参照，分别计算第一子代待分析数据和第二子代待分析数据在每个多态性位点上的SNP-index，统计平均值，得到两组SNP-index，分别为第一SNP-index和第二SNP-index；

9)取第一SNP-index和第二SNP-index差值的绝对值，绘制SNP-index图；选取95％和99％的置信水平作为筛选的阈值，超过阈值外的区域作为候选区域；

10)对所述候选区域内SNP的碱基与参考基因相应位置的碱基进行比对，统计第一亲本待分析数据、第二亲本待分析数据、第三亲本待分析数据、第一子代待分析数据和第二子代待分析数据中的碱基突变类型，筛选出亲本和与之近似的混池材料中碱基突变类型相一致的候选基因，作为候选基因；

11)利用Non-Redundant Protein Sequence、Gene Ontology和Kyoto EncyclopediaofGenes and Genomes数据库注释对所述候选基因进行初步筛选，得到目的基因；采用BRAD数据库和TAIR数据库对所述目的基因进行同源性分析和功能预测；

步骤1)中所述甘蓝型油菜纯合两型系D0721的保藏编号为：CCTCC NO：P202001；所述临保系D1577的保藏编号为CCTCC NO：P202002

步骤2)中所述恢复系D0936的保藏编号为CCTCC NO：P202003。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述第一子代备选植株和第二子代备选植株的数量分别为40～60株；所述第一亲本备选植株、第二亲本备选植株和第三亲本备选植株的数量分别为15～25株。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5)分别提取所述五组备选植株的基因组DNA后，还包括将提取到的五组备选植株的基因组DNA随机打断成350bp的片段，基于打断后的基因组DNA片段，采用TruSeq DNALT Sample Prep kit试剂盒分别构建文库。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤8)中所述SNP-index根据reads测序深度信息计算，利用测序reads对每个碱基位点的碱基进行统计，计算与作为参照的基因组不相同的reads条数占总条数的比例，得到碱基位点的SNP-index。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤8)所述统计平均值的过程中定位时以1Mb为窗口，以10Kb为步移。