[发明专利]DNB双末端测序方法

说明书

本发明提出了DNB双末端测序方法，所述方法包括：以DNA纳米球作为模板链进行测序；测序完成后，利用外切酶对合成的测序链进行消化；消化完成后，重新对所述模板链进行测序；或者以所述模板链生成互补链，并对所述互补链进行测序。利用外切酶将测序链进行消化，可以彻底去除测序链且基本不影响DNB状态，有助于重新测序或互补链的生成，最终保证测序数据的质量。

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及DNB双末端测序方法。

背景技术

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％，但存在测序成本高、通量低等方面的缺点，严重影响了其大规模应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术不仅大大降低了测序成本，而且还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。双末端测序在序列拼接上显得尤其重要，针对DNB-SEQ平台，互补链的生成质量对整个pair-end测序影响较大。DNB测序包括SE测序和pair-end测序，在SE测序过程中，可能出现失误导致这轮测序失败，造成样品损失及数据不可用，而在双末端测序中，完成SE测序后，通过链置换反应生成待测的互补链，再对其互补链进行测序，以保证测序数据的质量。

然而，目前DNB双末端测序方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的问题至少之一。为此，本发明提出了DNB双末端测序方法和试剂盒以及外切酶在DNB双末端测序中的用途，在DNB双末端测序过程中，利用外切酶将测序链进行消化，可以彻底去除测序链且基本不影响DNB状态，有助于重新测序或互补链的生成，最终保证测序数据的质量。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种DNB双末端测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：以DNA纳米球作为模板链进行测序；测序完成后，利用外切酶对合成的测序链进行消化；消化完成后，重新对所述模板链进行测序；或者以所述模板链生成互补链，并对所述互补链进行测序。

在DNB双末端测序过程中，以DNA纳米球作为模板链进行一链测序后，由于测序链(生成链)经过长cycle测序后，一些测序酶结合在测序链上以及带荧光阻断的dNTP切除后残留的scar都会影响Phi29酶的置换效果，从而影响互补链的拷贝数。

进而，发明人通过利用外切酶对合成的测序链进行消化，外切酶可以特异性的识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响，便于进行重新测序或是互补链生成，最终保证测序数据的质量。

根据本发明的实施例，上述DNB双末端测序方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述外切酶选自外切酶III。由此，采用外切酶III可以进一步特异性地识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响。

根据本发明的实施例，所述外切酶III的终浓度为0.2～0.9U/μL。由此，可以进一步提高消化效果。若浓度过低，无法完全有效地除去合成的测序链，从而对后续测序产生影响；若浓度过高，增加了测序成本。

根据本发明的实施例，所述消化的反应温度为35～40℃，时间为8～14分钟。由此，可以进一步提高消化效果，且缩短消化时间。若反应温度过低或时间过短，无法完全有效地除去合成的测序链，从而对后续测序产生影响；若反应温度过高，容易导致酶活性降低。