[发明专利]一种门冬胰岛素的制备方法

说明书

本发明提供了一种门冬胰岛素衍生物及其制备方法。具体地，本发明的方法在大肠杆菌中高密度表达包含绿色荧光蛋白折叠单元的门冬胰岛素融合蛋白，并对该融合蛋白进行酶切和纯化，制备门冬胰岛素。本发明的方法无需在固相有机体系下进行，减少工艺步骤，对环境污染小，成本更低，适宜推广。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种门冬胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。

门冬胰岛素作为一种速效胰岛素类似物，属于第三代胰岛素，由A、B两条链依靠两个半氨酸二硫键桥接而成，是利用基因工程DNA重组技术将人胰岛素B链第28位的脯氨酸(Pro)替换(突变)为负电荷的天冬氨酸(Asp)，利用电荷的排斥作用来阻止胰岛素单体或二聚体(一个胰岛素分子的B28与另外一个胰岛素分子的B23所形成)的自我聚合，使分子间的聚合减少。它能很好地模拟人胰岛素的分泌模式，其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右，其起效时间是10～20分钟，达峰时间为40分钟，作用持续时间缩短至3～5小时，使患者在获得良好的血糖控制的同时不易与下餐前或者夜间胰岛素作用发生叠加，显著减少了夜间低血糖的发生率。

门冬胰岛素的制备一般采用基因工程技术制备前体，原研公司诺和诺德以酿酒酵母为表达宿主，利用重组DNA技术生产得到门冬胰岛素前体，再通过转肽等一系列复杂工艺制备门冬胰岛素。该方法在宿主菌改造等反面技术难度大、工艺复杂。由于酿酒酵母自身表达能力较弱，因此门冬胰岛素产量不高，其工程菌摇床培养最高为21.5mg/L，一定程度上增加了药品生产成本。

因此，本领域迫切需要开发工艺简单、环境友好、收率高、产量高的门冬胰岛素的制备及纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种门冬胰岛素的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种重组门冬胰岛素融合蛋白，具有式I所示的结构：

A-FP-TEV-R-G (I)

式中，

“-”代表肽键；

A为无或前导肽，

FP为绿色荧光蛋白折叠单元，

TEV为酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点；

R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；

G为门冬胰岛素或其活性片段；

其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个，较佳地2-3个选自下组的β-折叠单元：