[发明专利]一种TOB1基因敲除单克隆细胞系的构建方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种TOB1基因敲除单克隆细胞系的构建方法和应用。本发明发现在猪肾上皮细胞系IBRS‑2中通过基因编辑技术敲除TOB1基因能够获得了一种抑制FMDV复制的单克隆细胞系细胞TOB1‑KOs；细胞系TOB1‑KOs经FMDV攻毒后，检测不到病毒核酸和蛋白，表明在IBRS‑2中敲除TOB1基因获得的单克隆细胞系TOB1‑KOs对具有FMDV抗性表型，能够完全抑制FMDV的复制，为未来预防或抑制FMDV感染提供一种可行策略。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种TOB1基因敲除单克隆细胞系的构建方法和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouthdiseaseviru s，FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病。该病可远距离传播，侵染对象为猪、牛、羊等主要畜种及其它偶蹄动物。发病动物的特征症状是口、鼻、蹄和母畜乳头等部位发生水泡，水泡破损后形成溃疡或斑痂，表现流涎、跛行和卧地，由此导致生产力大幅下降，可造成巨额经济损失和社会政治负面影响。世界动物卫生组织将该病列为法定上报的动物传染病之首，中国政府也将其排在一类动物传染病的首位。FMDV是具有二十面体对称结构的无包膜病毒，属于小RNA病毒科的口疮病毒属，其基因组是一条长度约8300nt的单股正链RNA，编码一条长的多聚蛋白，随后被病毒自身的蛋白酶切割形成4个结构蛋白、11个非结构蛋白和一系列的前体蛋白。

FMD流行地区的疫情控制是通过诊断、监测和定期大规模疫苗接种实现的，FMDV的灭活疫苗早在20世纪初就问世了，它的出现在一定程度上抑制了FMD的传播。FMDV有七种不同血清型，分别为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3，而各血清型之间的疫苗不存在交叉免疫保护，以灭活疫苗免疫动物后，动物免疫应答产生抗体所需时间长，体内的特异性抗体持续时间短；此外疫苗不能在病毒感染的初级部位完全抑制病毒的复制。因此，即使每年有大量的FMD疫苗投入使用，但是疫情仍然没有得到有效控制，疫情的爆发仍然影响着全球范围内数百万动物，并给大量FMD疫区的动物和动物产品贸易带来壁垒。因此，新型高效疫苗的研发需要更多的病毒与宿主相互作用的具体分子机制提供理论支持。

FMDV能够长期在全世界范围内肆虐，与其在与宿主的长期对抗过程中进化出了一系列抑制宿主抗病毒免疫应答的手段密不可分。FMDV感染宿主后利用宿主细胞完成自身生命周期，释放更多的病毒到环境中，宿主通过一系列的识别因子识别病毒，随后启动信号传递和级联放大机制激活自身的抗病毒免疫应答，包括了I型、III型干扰素通路和其它的具有抗增殖和免疫调节功能的抗病毒细胞因子表达通路，抑制病毒复制，达到清除病毒和维持自身健康的目的。在该病毒与宿主相互对抗的过程中，两者互相影响共同进化。几百年来，FMDV在全球广泛传播，多次在多个国家大规模爆发流行，不仅仅因为FMDV传播途径多、传播速度快、易感动物多、发病率高，更重要的是FMDV感染宿主后，与宿主相互作用，从多个层面通过多个途径抑制宿主的免疫应答导致的。首先，FMDV的多个非结构蛋白具有蛋白酶活性，通过对宿主蛋白的切割，可以在转录和翻译水平同时抑制宿主抗病毒分子的表达；其次，在对抗宿主的适应性免疫应答方面，FMDV能够抑制抗病毒细胞因子和干扰素刺激基因的，抑制宿主的MHC I类分子的分泌和表达，阻断或克服树突状细胞产生的初始IFNα应答，诱导宿主淋巴细胞减少；此外，FMDV还可以在极短的复制周期内产生大量的病毒，避免了细胞过早凋亡对病毒复制的不利影响。因此，通过对宿主细胞的改造来增强宿主细胞对FMDV的抗性，可以显著降低FMDV在宿主细胞中的复制。其中，通过基因功能缺失和功能获得的手段可获得具有FMDV病毒抗性的细胞株系。

ErbB2结合蛋白(Transducer of ErbB2.1，TOB1)是一个肿瘤抑制蛋白，它是酪氨酸受体激酶ErbB2的负调节因子。

本发明意外发现在宿主中缺失TOB1基因，获得的了具有FMDV抗性表型的宿主细胞，能够抑制FMDV复制。

发明内容