[发明专利]一种菜薹非转基因突变株的创制方法

说明书

本发明公开了一种菜薹非转基因突变株的创制方法。本发明所提供的创制白菜非转基因突变株的方法，是通过将CRISPR/Cas9技术与白菜原位转化技术相结合实现的，具体包括如下步骤：将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体通过真空渗入原位转化的方法导入受体白菜。本发明在2032粒种子中获得了两粒PDS等位基因敲除，率先通过不依赖于组织培养的原位转化技术获得非转基因编辑突变株。编辑效率较之前报道的原位转基因效率大大提高，也为转基因安全和无标记基因编辑提供了一个很好的研究思路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种菜薹非转基因突变株的创制方法。

背景技术

由于食品安全和基因漂移的问题，转基因安全性一直被人们关注。而CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术可以替代传统的转基因技术而获得非转基因改良材料。通常可以通过对转基因后代有性繁殖和标记选择去除掉含Cas9/sgRNA的外源载体，并保留编辑突变的方法获得安全的非转基因改良材料。同时CRISPR/Cas9技术也提供了无需后代分离而直接获得非转基因突变株的可能。包括农杆菌介导的CRISPR/Cas9瞬时表达(Chen et al.,2018；Iaffaldano et al.,2016)，Cas9/gRNA复合体(RNP)转染(Woo et al.,2015；Murovec etal.,2018；Park et al.,2019)等，但都依赖于组织培养和离体再生。

白菜作为主要蔬菜作物，其转化技术研究进展缓慢，主要由于它的外植体出芽困难，转化效率低。农杆菌介导的浸花(floral-dip)转化方法是一种较简便的不依赖于组织培养的转基因方法。该方法的优点在于可以避开组织培养和离体再生，直接获得转基因的种子，方法简单，省时省力。近年来，很多学者利用原位转化的方法对白菜进行转基因研究，取得了一些可喜进展。曹鸣庆(2000)通过真空渗入法对不结球白菜成功进行转化；严继勇(2003)采用微注射的方法对小白菜进行了转化；另外张广辉(1998)，严继勇(2004)，于占东(2007)通过真空渗入的方法对大白菜成功进行了转化，但转化效率低，多在0.01％左右。菜薹(Brassica campestris L.ssp.chinensis)为不结球白菜类型中以幼嫩花茎为主要食用器官的一个常规栽培品种，播种至产品收获需约40-60天，是研究白菜类蔬菜原位转化技术的好材料。

目前虽有白菜遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系建立相关报道，但是尚未有将原位转化和CRISPR/Cas9技术相结合创制白菜非转基因突变株的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种菜薹非转基因突变株的创制方法。

本发明所提供的创制白菜非转基因突变株的方法，是通过将CRISPR/Cas9技术与白菜原位转化技术相结合实现的。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体通过真空渗入原位转化的方法导入受体白菜。

更进一步地，所述方法可包括如下步骤：

(A1)将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体导入农杆菌，得到重组农杆菌。

(A2)待受体白菜进入初花期时，按照如下进行浸花处理：将花蕾浸没在所述重组农杆菌的重悬液中，于100-105Pa(如104Pa)负压条件下真空处理10分钟。

其中，将花蕾浸没在所述重组农杆菌的重悬液中，具体可按照如下进行：将要开放的花蕾用镊子拨开，浸花时将枝条弯曲，使整个花序浸泡在所述重组农杆菌的重悬液。

(A3)从经过(A2)浸花处理的所述受体白菜最终所结种子中即可获得所述目标基因被敲除的非转基因突变株。